[發(fā)明專利]可顯著提高棉花黃萎病抗性的基因GauRev2及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110480145.6
• 申請(qǐng)日: 2021-04-30
• 公開（公告）號(hào): CN113234729B
• 公開（公告）日: 2022-07-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 周寶良;劉富杰;馮國禮
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/29
• 分類號(hào): C12N15/29;C07K14/415;C12N15/84;A01H5/00;A01H6/60;A01H6/20
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責(zé)任公司 32218
• 代理人: 徐冬濤;李曉峰

本發(fā)明公開了一種可顯著提高棉花黃萎病抗性的基因GauRev2及其應(yīng)用，該基因具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。本發(fā)明通過病毒介導(dǎo)的基因沉默技術(shù)抑制棉花中GausREV2基因的表達(dá)，接菌黃萎病菌孢子懸浮液后，沉默植物表現(xiàn)的更感病。在擬南芥中，異源過表達(dá)GausREV2能顯著提高對(duì)黃萎病的抗性。GausREV2的發(fā)現(xiàn)和利用將有助于培育抗黃萎病的棉花品種，解決棉花生產(chǎn)上的難題。通過深入研究GausREV2對(duì)黃萎病抗性的分子機(jī)理，對(duì)棉花育種家選育高抗黃萎病棉花品種具有重要的理論意義。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程育種技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及可顯著提高棉花黃萎病抗性的基因GauRev2及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

棉花黃萎病是由大麗輪枝菌(Verticillium dahlia)引起的一種土傳性真菌病害，環(huán)境條件適宜時(shí)，棉花連作常造成黃萎病的大面積發(fā)生(Atallah and Subbarao,2012)，其致病部位主要在植物的維管束組織，棉花一旦發(fā)病將無法防治；更為重要的是，棉花黃萎病菌具有很強(qiáng)的生物適應(yīng)性，在低溫(10℃)和高溫(30℃)條件下均可以生長，在逆境條件下，還會(huì)產(chǎn)生微菌核的休眠結(jié)構(gòu)，來躲避不良環(huán)境(簡桂良等，2003，朱荷琴等，2003)。這些特征導(dǎo)致黃萎病難以根除，因而在棉花生產(chǎn)中具有棉花的“癌癥”之稱(Inderbitzin et al.,2011)。因此，培育抗病品種供生產(chǎn)應(yīng)用是最為經(jīng)濟(jì)有效的手段。然而，現(xiàn)有的栽培品種普遍不抗病，而且嚴(yán)重缺乏抗性基因。因此，為了滿足我國棉花抗黃萎病育種的需求，突破我國抗病育種的基因資源瓶頸，從野生棉中挖掘和利用抗病基因顯得十分必要。

棉屬(Gossypium spp)有52個(gè)種，其中48個(gè)是野生種(Fryxell，1992)。研究表明，在野生種中存在高抗黃萎病的基因(顧本康等，1993)。澳洲棉(Gossypium australe，2n＝GG＝26)原產(chǎn)于澳大利亞，是一個(gè)對(duì)枯、黃萎病兼抗的二倍體野生棉種，而且它還對(duì)黃萎病多種菌系具有廣譜抗性，抗性遠(yuǎn)強(qiáng)于海島棉和陸地棉，是棉花抗病育種的重要基因資源，在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所資源庫中常規(guī)保存(種子或活體)。然而，由于澳洲棉屬于三級(jí)基因庫棉種，長期以來，由于缺乏必要的前期研究，在育種中無法得以利用。專利申請(qǐng)人在前期做了十多年的大量研究，在國際上首次利用澳洲棉與陸地棉雜交，創(chuàng)建了陸地棉-澳洲棉染色體異附加系，利用陸地棉-澳洲棉人工合成的多倍體，經(jīng)過花粉處理，獲得了獨(dú)有的高抗黃萎病的易位系T01A-7G，為發(fā)掘澳洲棉的抗黃萎病基因奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

本發(fā)明就是利用來自野生種澳洲棉的高抗黃萎病的陸地棉-澳洲棉染色體易位系(TA01-7G)，該易位系含有一個(gè)來自澳洲棉的染色體片段，通過比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究，從接種黃萎病菌的轉(zhuǎn)錄組文庫中得到一條來自于澳洲棉的REVILLE基因序列，其表達(dá)顯著受黃萎病的誘導(dǎo)，其屬于MYB-like轉(zhuǎn)錄因子(MYBL)，我們將澳洲棉的這個(gè)基因命名為GausREV2基因。序列分析表明，GausREV2的cds全長為1374bp，編碼457個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，利用病毒介導(dǎo)的沉默技術(shù)，抑制GausREV2的表達(dá)，接種黃萎病菌V991的孢子懸浮液后，表現(xiàn)為更感病。通過轉(zhuǎn)基因的手段，在擬南芥中異源過表達(dá)GausREV2。過表達(dá)植株相比野生型植株，表現(xiàn)出對(duì)黃萎病更強(qiáng)的抗性。

MYB轉(zhuǎn)錄因子是植物中最大的基因家族之一，調(diào)控植物體內(nèi)的多種生物進(jìn)程，在植物應(yīng)對(duì)生物脅迫和非生物脅迫中發(fā)揮重要的作用。第一個(gè)被鑒定的MYB基因是禽類白血病病毒的致癌基因v-Myb，其起源于脊椎動(dòng)物，進(jìn)入病毒基因組后發(fā)生突變。后來研究發(fā)現(xiàn)，玉米中的cl基因所編碼的蛋白就是一個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子，是植物中第一個(gè)被報(bào)道的MYB基因。在擬南芥中過表達(dá)AtMYB30，能夠增強(qiáng)植物對(duì)病原菌的抵抗力(Vailleau et al.,2002)。另一個(gè)R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子AtBOS1受到灰霉病菌侵染的誘導(dǎo)，起到傳導(dǎo)活性氧和茉莉酸信號(hào)，激活植物的免疫反應(yīng)(Mengiste et al.,2003)。在擬南芥中，異源表達(dá)櫻桃的PacMYBA基因，正向調(diào)節(jié)對(duì)假單胞菌的抗性(Shen et al.,2017)。棉花中的GhMYB108和GhCML11互作增強(qiáng)對(duì)黃萎病的抗性。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的GausREV2基因不同于所有前人已研究的MYB轉(zhuǎn)錄因子基因。