[發明專利]一種適用于規模化提取dsRNA的方法和應用

有效

• 申請號: 202110478812.7
• 申請日: 2021-04-29
• 公開（公告）號: CN113136383B
• 公開（公告）日: 2023-08-04
• 發明（設計）人: 秦斌鈺;肖建輝;馬櫻芳;李學文;唐詩語;黃永奎
• 申請（專利權）人: 硅羿科技（上海）有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 焦作加貝專利代理事務所(普通合伙) 41182
• 代理人: 馮新志

本發明公開了一種新型的高效規模化提取dsRNA的方法，具體公開一種新型的高效規模化提取微生物工程菌表達的dsRNA的方法，屬于生物技術領域。所述方法包括菌體的預處理，緩沖液的配制和添加，兩步法均質，切向流濃縮，填料的預處理，兩步法結合洗脫。利用本發明的方法提取dsRNA，操作步驟簡單，成本低。提取得到的dsRNA在低溫干燥后純度達90%以上，收率可達80%以上。本發明的方法十分有利于規模化dsRNA提取的應用，具有重要的經濟價值。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體地，涉及一種適用于規模化提取dsRNA的方法和應用。

背景技術

RNA干擾(RNA?interference，RNAi)是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈RNA(double-stranded?RNA，dsRNA)誘發的、同源mRNA高效特異性降解的現象。簡單的說是指一種分子生物學上由雙鏈RNA誘發的基因沉默(RNA?silencing)現象。當細胞中導入與內源性mRNA編碼區同源的雙鏈RNA時，該mRNA發生降解而導致基因表達沉默，是一種特異性的轉錄后基因沉默(post-transcriptional?gene?silencing，PTGS)。RNAi技術的本質是利用小的雙鏈RNA，高效、特異的阻斷體內特定基因表達，促使mRNA降解，誘使細胞表現出特定基因缺失表型。它是體內抵御病毒感染和基因損傷的一種重要的保護機制。

眾所周知，在農業生產中，害蟲對農作物的生長可以帶來毀滅性的影響，每年因為害蟲危害而造成的農作物損失約占農作物總體損失的10％以上。農業害蟲不僅能以自身危害的方式給農作物帶來直接損失，還可通過傳播植物病毒病害的方式危害農作物。目前，對農業害蟲防治主要以化學防治手段為主，化學農藥對農業豐收的貢獻率達35％以上。雖然防效顯著，但其副作用日益顯現。例如誘發害蟲產生抗藥性、導致農產品中農藥殘留增加、破壞農田生態系統、造成環境污染等，這些副作用均嚴重影響了農業的可持續發展，特別是人類健康帶來危害。我國每年生產近150萬噸以上的各類化學農藥，對人類、環境、農產品安全和食品安全的潛在威脅日益嚴峻，因此，研究新型、安全、高效的、無殘留的害蟲防治途徑是農業生產可持續發展的重要內容。

RNAi現象在自然界生物中普遍存在，在農業害蟲也不例外。目前，RNAi技術已經應用到農業害蟲的抗藥性功能基因分析、表觀遺傳學分析等領域。而在害蟲防治領域，RNAi技術研究的主要任務是通過抑制必需基因的轉錄和翻譯，從而降低害蟲的適應度或致死害蟲。轉入植物體內的dsRNA被稱為內源性dsRNA殺蟲劑，如美國孟山都公司把編碼Dvfnf7基因的dsRNA轉入到玉米里，可以防治西方玉米根蟲，2018年被FDA以殺蟲劑登記上市。dsRNA也可以直接噴灑到植物表面作為外源性的殺蟲劑，它可以通過害蟲進食或與病原菌直接接觸結合進行病蟲害的防治。

基于dsRNA制備的RNAi干擾技術的應用將給農業害蟲防治帶來革命性的變化。現有dsRNA的提取方法主要分為化學法和生物法。化學法操作繁瑣，價格昂貴，提取量小，無法實現規模化提取；常規生物法使用各種酶催化合成，得到的dsRNA純度低，得率低。

發明內容

為了解決上述技術問題中的至少一個，本發明旨在提供一種新型的高效的規模化提取dsRNA的工藝技術。為了達到該目的，本發明采取的技術方案如下：

本發明第一方面提供一種適用于規模化提取dsRNA的方法，包括以下步驟：

S1，將含有dsRNA的生物樣本放置于-20℃預冷2-12h，優選6h，取出菌體，常溫溶解后加入緩沖液a，添加量為菌體質量的2-10倍，優選為菌體質量的5倍，用攪拌槳充分混勻，4℃低溫離心5-30min，優選10min，優選地，離心轉速3000-9000rpm，更優選離心轉速5000rpm，離心去上清，得到預處理的菌體；

S2，取出步驟S1獲得的預處理菌體，加入緩沖液b配制成菌體濃度為3-20％的溶液，優選地，配制成菌體濃度為5％的溶液，用攪拌槳20-100rpm優選80rpm充分混勻；