[發(fā)明專利]抑制J亞群禽白血病病毒復(fù)制的組合物及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110474266.X
• 申請(qǐng)日: 2021-04-29
• 公開（公告）號(hào): CN113274510B
• 公開（公告）日: 2022-05-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 趙鵬;王群;王一新;常爽
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): A61K48/00
• 分類號(hào): A61K48/00;A61K31/713;A61K31/513;A61P35/02;C12N15/85;C12N15/113
• 代理公司: 濟(jì)南譽(yù)豐專利代理事務(wù)所(普通合伙企業(yè)) 37240
• 代理人: 薛鵬喜

本發(fā)明公開了一種抑制J亞群禽白血病病毒復(fù)制的組合物及其應(yīng)用，屬于獸用生物制品技術(shù)領(lǐng)域。所述抑制J亞群禽白血病病毒復(fù)制的組合物包括：shRNA表達(dá)質(zhì)粒和AZT；所述shRNA表達(dá)質(zhì)粒是由shRNA序列連接入質(zhì)粒載體中構(gòu)建而成。應(yīng)用shRNA表達(dá)載體及逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑AZT在清除細(xì)胞內(nèi)的ALV的作用上具有協(xié)同效果，兩者聯(lián)合應(yīng)用能夠顯著降低DF?1細(xì)胞內(nèi)禽白血病病毒的病毒量以及p27抗原水平，能夠顯著抑制ALV復(fù)制，在細(xì)胞水平上具有較好的抗禽白血病病毒效果。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及獸用生物制品技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種抑制J亞群禽白血病病毒復(fù)制的組合物及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

禽白血病(Avian leukosis，AL)是由禽白血病病毒(Avianleukosis virus，ALV)引起的、禽類多種腫瘤性疾病的統(tǒng)稱，主要表現(xiàn)為雞的良性、惡性腫瘤和亞臨床感染，導(dǎo)致雞只生長(zhǎng)遲緩、產(chǎn)蛋下降和免疫抑制。自AL被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，該病呈現(xiàn)出世界性流行趨勢(shì)，近年來(lái)在中國(guó)雞群中廣泛傳播，對(duì)雞群的安全構(gòu)成了嚴(yán)重威脅，給我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展帶來(lái)了巨大困擾，并給地方品種雞保種和選育工作帶來(lái)很大的困難。禽白血病病毒屬于反轉(zhuǎn)錄病毒科、正反錄病毒亞科、甲型反轉(zhuǎn)錄病毒屬。該科病毒的基因組為RNA，以具有反轉(zhuǎn)錄酶為特征。目前，根據(jù)gp85基因的特性，將ALV分為A、B、C、D、E、F、G、H、I、J和K共11個(gè)亞群。目前，ALV-J在很多種類雞群中均發(fā)現(xiàn)感染且病毒呈現(xiàn)出極大的基因多樣性。鑒于該病的重大危害，《國(guó)家中長(zhǎng)期動(dòng)物疫病防治規(guī)劃(2012-2020年)》將AL列為我國(guó)需要優(yōu)先凈化的禽病。ALV主要通過(guò)種蛋垂直傳播，另外，使用了被ALV污染的弱毒疫苗也是該病傳播的一個(gè)重要方式。目前，尚無(wú)針對(duì)禽白血病的商品化疫苗與特效藥物，主要通過(guò)對(duì)現(xiàn)有種雞群凈化來(lái)控制該病。

齊多夫定(Zidovudine，AZT)是一種核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑具有抗逆轉(zhuǎn)錄酶的活性，能夠在組織培養(yǎng)中抑制HIV復(fù)制，臨床試驗(yàn)證明它能延緩艾滋病程，推遲機(jī)會(huì)性感染。先前，已有研究證明了藥物能夠在一定程度上抑制J亞群禽白血病病毒的復(fù)制。由于AZT與脫氧胸腺嘧啶核苷酸(T)很相似，逆轉(zhuǎn)錄酶也錯(cuò)將其利用，但因其脫氧核糖的第3位缺少羥基，不能與另一核糖核苷酸上的第5’端的羥基與磷酸酯化相連，因此不能夠形成3,5-磷酸二酯鍵，DNA鏈的編碼被中斷了，因此阻礙了逆轉(zhuǎn)錄病毒的復(fù)制。

RNA干擾(RNA interference，RNAi)是通過(guò)內(nèi)源性或外源性雙鏈RNA(doublestrand RNA，dsRNA)的介導(dǎo)，特異性降解相應(yīng)序列的mRNA，導(dǎo)致靶基因的表達(dá)沉默，產(chǎn)生相應(yīng)的功能型缺失，屬于轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默(post-transcript gene silencing，PTGS)現(xiàn)象。作為古老的、進(jìn)化保守的基因沉默機(jī)制，RNAi對(duì)細(xì)胞防御病毒的感染、修復(fù)遺傳損傷及調(diào)節(jié)正常的基因功能具有重要作用。現(xiàn)在，RNAi作為一種簡(jiǎn)單有效的分子生物學(xué)工具，研究人員通常采用化學(xué)合成，或質(zhì)粒載體、病毒載體表達(dá)所需要的dsRNA，進(jìn)而誘導(dǎo)特異有效的RNAi進(jìn)行基因功能研究和疾病治療。前期研究表明，通過(guò)設(shè)計(jì)針對(duì)不同靶位點(diǎn)的siRNA(如有研究針對(duì)gag基因、env基因或LTR區(qū)域)，可以有效干擾ALV-J的復(fù)制。

但是，AZT雖然可以在細(xì)胞水平上抑制ALV-J的復(fù)制，具有一定的效果，但高劑量AZT會(huì)對(duì)細(xì)胞造成損傷；而且，高劑量AZT的長(zhǎng)期使用可能會(huì)導(dǎo)致耐藥毒株的出現(xiàn)。RNAi是一種強(qiáng)有效的抑制基因功能的工具，但RNAi技術(shù)的難點(diǎn)在于如何選擇靶標(biāo)區(qū)域設(shè)計(jì)shRNA表達(dá)質(zhì)粒，針對(duì)ALV-J病毒基因組不同靶基因的RNAi在抑制禽白血病病毒復(fù)制的效果各不相同；而且，RNAi技術(shù)一般是單獨(dú)使用，目前還很少見(jiàn)有基于RNAi技術(shù)設(shè)計(jì)的shRNA表達(dá)質(zhì)粒與其他藥物聯(lián)合應(yīng)用治療J亞群禽白血病的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的目的是提供一種抑制J亞群禽白血病病毒復(fù)制的組合物及其應(yīng)用。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用shRNA表達(dá)載體及逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑AZT在清除細(xì)胞內(nèi)的ALV的作用上具有協(xié)同效果，兩者聯(lián)合應(yīng)用能夠顯著降低DF-1細(xì)胞內(nèi)禽白血病病毒的病毒量以及p27抗原水平，能夠顯著抑制ALV復(fù)制，在細(xì)胞水平上具有較好的抗禽白血病病毒效果。