[發明專利]馬鈴薯黑脛病菌的特異性引物、探針及其應用

有效

• 申請號: 202110472615.4
• 申請日: 2021-04-29
• 公開（公告）號: CN112961928B
• 公開（公告）日: 2022-11-25
• 發明（設計）人: 蘇振賀;郭慶港;馬平;李社增;鹿秀云;董麗紅;王培培;張曉云;趙衛松;曲遠航
• 申請（專利權）人: 河北省農林科學院植物保護研究所
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6851;C12Q1/06;C12N15/11;C12R1/01
• 代理公司: 北京細軟智谷知識產權代理有限責任公司 11471
• 代理人: 尚文文

本發明屬于生物技術領域，具體涉及馬鈴薯黑脛病菌的特異性引物、MGB探針及其應用。本發明的馬鈴薯黑脛病菌的特異性引物和探針，引物的核苷酸序列為：BL4?F：5’?GCCGTTGAAACGACCATGAG?3，BL4?R:5'?GGTATCAACGGTTTTGGCCG?3'；所述探針的序列為：BL4probe：5'?TATACGCCATGTAATCAGCA?3'。本發明的引物及探針聯合應用具有良好的特異性、高靈敏度、高準確度，模版在1×10¹～1×10⁶拷貝/μL范圍內均可以準確檢出。因此，本發明的特異性引物及探針可用于馬鈴薯黑脛病病菌數量的確定，并為馬鈴薯黑脛病的發生提供預測預報。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及馬鈴薯黑脛病菌的特異性引物、MGB探針及其應用。

背景技術

馬鈴薯黑脛病是一種廣泛分布的全球性植物疾病，主要由果膠桿菌引起，該病害的特點為發病快、死亡率高、防治難，對馬鈴薯的品質和產量造成嚴重的影響。種薯帶菌是馬鈴薯黑脛病重要的感染源，因此種薯中病原菌數量往往是病害流行的主要決定因素。在實際檢測工作中，普通PCR方法靈敏度低且不可定量；LAMP法快速、靈敏，但易出現假陽性；普通Taqman探針定量PCR法由于探針長度太長，敏感性不佳。

TaqMan-MGB具有諸多優勢，例如，探針3'端的MGB結合物可提高探針的Tm值，縮短高Tm值探針的序列長度，非常適合富含AT序列的探針設計；TaqMan-MGB探針理論上只要有一個堿基差異，探針就不會與目的片段結合，因此不產生熒光信號，故特異性強；此外，MGB探針序列短，3'端不發光的淬滅基團與報告基團的空間距離更接近，淬滅效果更佳，故探針間雜交的背景弱，穩定性和分辨率更高。然后，現有技術沒有可特異性檢測馬鈴薯黑脛病胡蘿卜軟腐果膠桿菌的引物及MGB探針。

發明內容

本發明的目的在于提供一種馬鈴薯黑脛病菌的特異性引物和探針。

本發明的再一目的在于提供上述引物和探針的應用。

本發明的再一目的在于提供檢測馬鈴薯黑脛病菌的檢測試劑盒。

本發明的再一目的在于提供檢測馬鈴薯黑脛病菌的檢測方法。

本發明的胡蘿卜軟腐果膠桿菌(Pectobacterium carotovorum)BL-4于2021年03月16日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，郵編：100101)，保藏編號為CGMCC.22021。

根據本發明具體實施方式的馬鈴薯黑脛病菌的特異性引物和探針，所述引物核苷酸序列為：

SEQ ID NO.1:5'-GCCGTTGAAACGACCATGAG-3'，

SEQ ID NO.2:5'-GGTATCAACGGTTTTGGCCG-3'；

所述探針的核苷酸序列為：

SEQ ID NO.3:5'-TATACGCCATGTAATCAGCA-3'。

根據本發明具體實施方式的馬鈴薯黑脛病菌的特異性引物和探針，所述探針的5’端標記熒光基團，3’端標記淬滅基團。其中，熒光基團可選FAM、HEX、TET等，淬滅基團可選TAMRA、BHQ、MGB等。

根據本發明具體實施方式的馬鈴薯黑脛病菌的特異性引物和探針，所述探針的5'端標記有FAM熒光染料，所述探針的3'端標記有淬滅基團MGB。

根據本發明具體實施方式的馬鈴薯黑脛病菌的特異性引物和探針，馬鈴薯黑脛病菌為胡蘿卜軟腐果膠桿菌，尤其是胡蘿卜軟腐果膠桿菌BL-4。

本發明提供馬鈴薯黑脛病菌的特異性引物和探針的應用,尤其是在定量檢測胡蘿卜軟腐果膠桿菌含量方面的應用。