[發(fā)明專利]光棘球海膽活體性別鑒定用DNA分子標(biāo)記及鑒定方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110470719.1
• 申請(qǐng)日: 2021-04-29
• 公開（公告）號(hào): CN113046446B
• 公開（公告）日: 2023-05-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 常亞青;孫志惠;崔洲平
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 大連海洋大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/6888
• 分類號(hào): C12Q1/6888;C12Q1/6879;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 大連非凡專利事務(wù)所 21220
• 代理人: 閃紅霞

本發(fā)明公開一種光棘球海膽活體性別鑒定用DNA分子標(biāo)記及鑒定方法，DNA分子標(biāo)記的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示，鑒定方法按照如下步驟進(jìn)行：采集光棘球海膽管足，提取光棘球海膽DNA；以所得到的DNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)，所述PCR反應(yīng)上下游引物的核苷酸序列分別如SEQ?ID?NO：2和SEQ?ID?NO：3所示；所述PCR反應(yīng)體系為模板30~100ng，2XPCRmix10μL，上游引物2μmol，1μL，下游引物2μmol，1μL，滅菌水補(bǔ)至20μl；所述PCR反應(yīng)程序?yàn)?8℃變性30s；98℃變性10s、60℃退火15s、72℃延伸1min、進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72℃后延伸5min；4℃保存PCR反應(yīng)產(chǎn)物；對(duì)PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，擴(kuò)增出長(zhǎng)度為362bp特異性條帶的為雌性個(gè)體，否則為雄性個(gè)體。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于水產(chǎn)養(yǎng)殖性別鑒定技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種光棘球海膽活體性別鑒定用DNA分子標(biāo)記及鑒定方法。

背景技術(shù)

光棘球海膽（ Strongylocentrotus?nudus）是重要的海水養(yǎng)殖品種，市場(chǎng)價(jià)值極高，性腺組織是其唯一可食用部分。近年來，巨大的市場(chǎng)需求推動(dòng)了養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，也導(dǎo)致了野生資源的衰退，培育優(yōu)良品種及實(shí)現(xiàn)性控育種是目前海膽?zhàn)B殖產(chǎn)業(yè)的難題。然而，光棘球海膽不具備明顯的性別二態(tài)性，在其生長(zhǎng)發(fā)育的各個(gè)階段都無法從外觀分辨性別，這嚴(yán)重阻礙了光棘球海膽良種培育和單性群體養(yǎng)殖的進(jìn)程。目前，海膽性別鑒定方法大多數(shù)需要解剖獲得性腺，通過組織學(xué)切片或基因表達(dá)定量分析，無法滿足活體鑒定的要求。DNA分子標(biāo)記是活體性別鑒定的重要工具，不受發(fā)育時(shí)期、環(huán)境等因素的限制，使用PCR操作技術(shù)即可實(shí)現(xiàn)鑒定，具有操作簡(jiǎn)單快速、結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。但是，迄今為止并沒有基于DNA分子標(biāo)記進(jìn)行光棘球海膽活體性別鑒定的相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明是為了解決現(xiàn)有技術(shù)所存在的上述技術(shù)問題，提供一種光棘球海膽活體性別鑒定用DNA分子標(biāo)記及鑒定方法。

本發(fā)明的技術(shù)解決方案是：一種光棘球海膽活體性別鑒定用DNA分子標(biāo)記，核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1?所示。

一種基于上述光棘球海膽性別鑒定用DNA分子標(biāo)記的鑒定方法，其特征在于按照如下步驟進(jìn)行：

a.?采集光棘球海膽管足，提取光棘球海膽DNA；

b.?以所得到的DNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)，所述PCR反應(yīng)上下游引物

的核苷酸序列分別如SEQ?ID?NO：2?和SEQ?ID?NO：3所示；所述PCR反應(yīng)體系為模板30~100ng，2XPCRmix10μL，上游引物2μmol，1μL，下游引物2μmol，1μL，滅菌水補(bǔ)至20μl；所述PCR反應(yīng)程序?yàn)?8℃變性30s；98℃變性10s、60℃退火15s、72℃延伸1min、進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72℃后延伸5min；4℃保存PCR反應(yīng)產(chǎn)物；

c.對(duì)PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，擴(kuò)增出長(zhǎng)度為362bp特異性條帶的為雌性個(gè)體，否則為雄性個(gè)體。

本發(fā)明只需采集少量光棘球海膽的管足組織，即可實(shí)現(xiàn)活體性別鑒定，準(zhǔn)確率達(dá)100%，采集管足后個(gè)體的生長(zhǎng)狀態(tài)及存活率與對(duì)照組相比無明顯差異，具有操作簡(jiǎn)單、快速及可信度高等優(yōu)點(diǎn)。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實(shí)施例樣本的PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)結(jié)果圖。

圖2是本發(fā)明實(shí)施例樣本性腺組織學(xué)判定結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式