[發(fā)明專利]重組釀酒酵母菌株及其構建方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110467433.8
• 申請日: 2021-04-28
• 公開（公告）號: CN113308442B
• 公開（公告）日: 2023-06-27
• 發(fā)明（設計）人: 元英進;吳楠;杜現(xiàn)禮;王穎;姚明東;段小濤;肖文海
• 申請（專利權）人: 天津大學;中國人民解放軍軍事科學院軍事醫(yī)學研究院
• 主分類號: C12N9/00
• 分類號: C12N9/00;C12N9/10;C12N9/06;C12N15/81;C12N1/19;C12P17/18;C12R1/865
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 張柳

本發(fā)明涉及合成生物學領域，具體涉及生產田麥角堿的重組釀酒酵母菌株(Saccharomyces?cerevisiae)及其構建方法。該菌株命名為釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)SyBE_Sc06130032，簡稱SyBE_Sc06130032。本發(fā)明還提供了在釀酒酵母中從頭構建合成田麥角堿的方法，easA成功篩選到一個新的來源，克服了在關鍵分支點合成田麥角堿的難點，進一步解析了田麥角堿的合成路徑，為麥角生物堿的異源合成奠定了基礎。

技術領域

本發(fā)明涉及合成生物學領域，特別涉及重組釀酒酵母菌株及其構建方法。

背景技術

麥角生物堿主要是曲霉(Aspergillus)，麥角菌屬(Claviceps)以及內生真菌(Neotyphodium)這三類真菌的次生代謝產物，它是一類具有較強藥理活性的真菌類吲哚類生物堿天然產物，是治療偏頭痛、子宮出血、帕金森癥和其他疾病的治療藥物的原料。生物堿類藥物通常從植物提取的起始原料中半合成，這往往限制了它們的可用性和最終價格。近年來合成生物學的進展使得將完整的植物途徑引入微生物中來生產植物生物堿成為可能。

微生物生產改性生物堿具有加速生物堿類藥物半合成的潛力，它提供了結構上更接近最終藥物的高級中間體，可作為新型藥物合成的高級中間體。幾十年來，人們對麥角生物堿進行了深入的研究，主要是因為它們在受污染的食品和飼料中的有害作用，但也因為它們在醫(yī)藥和農業(yè)方面的有益應用。

麥角生物堿合成的源頭底物為色氨酸和二甲烯丙基焦磷酸(DMAPP)，盡管目前其生物合成路徑中的共同前體可以確定為裸麥角堿，但是裸麥角堿的下游合成路徑并不是十分清晰，具體的催化機理，反應機制不清楚。而涉及chanoclavine-I形成的一共需要四個酶，分別為dmaw和easF、EasE和EasC，dmaw和easF這兩步酶不是限制chanoclavine-I形成的因素，關鍵是EasE和EasC的研究。2014年，Curt?AF?Nielsen等研究者成功地在釀酒酵母中以色氨酸和DMAPP合成了裸麥角堿，篩選到來自日本曲霉的EasE和EasC這兩個蛋白實現(xiàn)了裸麥角堿的合成，使得EasE和EasC在酵母異源中表達成為可能，關鍵酶EasE和EasC的研究依賴于真菌的基因互補，但進一步的表征則受到EasE蛋白表達困難的阻礙。最終發(fā)現(xiàn)EasE的N端ER靶向信號肽對在酵母中表達活性有影響，研究者對EasE信號肽做了截短驗證，并沒有將其他酶共同作細胞器定位嘗試。2015年，Dorota?Jakubczyk等研究者在釀酒酵母中實現(xiàn)了從頭合成cycloclavine，裸麥角堿的一步下游產物，通過增加了三個拷貝數(shù)的dmaw、四個拷貝數(shù)的easC實現(xiàn)了cycloclavine產量為529mg/L，裸麥角堿產量為0.75mg/L，平行副產物羊茅麥角堿89mg/L，發(fā)酵優(yōu)化發(fā)現(xiàn)低溫22℃對EasE和EasC催化速率有明顯提高使得chanoclavine-I產量翻了十幾倍。2010年，Johnathan?Z.Cheng等研究者發(fā)現(xiàn)在麥角生物堿合成路徑中EasA是一個重要的分支控制點，序列比對發(fā)現(xiàn)easA與黃素酶高度同源，EasA負責兩個功能分別為異構化和還原性。2011年，Marco?Matuschek等研究者通過在大腸桿菌中表達獲得可溶性蛋白EasG，體外通過控制還原性谷胱甘肽(GSH)的量與NADPH，裸麥角堿醛混合孵育，最終獲得田麥角堿。在麥角生物堿合成路徑中GSH替代了EasA的作用，對此說明EasA的具體催化機理或者說裸麥角堿醛到田麥角堿的催化機制依然是不清楚的。2019年，Yongpeng?Yao等研究者又進一步解析了EasC的催化反應機制，EasC主要負責麥角生物堿中心碳環(huán)的生物合成，研究者提出自由基理論，解釋了EasC的雙功能——過氧化氫酶和單加氧酶功能。到目前為止，在異源宿主中進行合成田麥角堿的難度在于EasA酶的功能分配，還原性功能的表達將裸麥角堿醛流向羊茅麥角堿，已實現(xiàn)了89mg/L的滴度。

田麥角堿作為麥角生物堿合成路徑上一個重要分支點走向的中間產物，對開發(fā)生物合成麥角酸衍生物系列占有舉足輕重的地位，而在麥角生物堿中麥角酸衍生物是主要用于醫(yī)藥開發(fā)的一類，到目前為止在釀酒酵母中還未實現(xiàn)其全合成，因此田麥角堿的異源表達成功對下游麥角生物堿的研究具有十分重要意義。