[發明專利]亞洲型寨卡病毒RT-RIA/CRISPR-Cas12a檢測試劑盒及其檢測方法

在審

• 申請號: 202110466902.4
• 申請日: 2021-04-28
• 公開（公告）號: CN113005230A
• 公開（公告）日: 2021-06-22
• 發明（設計）人: 陳峰;吳海磊;唐曉宇;楊國平
• 申請（專利權）人: 南通海關綜合技術中心（江蘇國際旅行衛生保健中心南通分中心;南通海關口岸門診部）
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12R1/93
• 代理公司: 石家莊科途知識產權代理事務所(普通合伙) 13141
• 代理人: 檀文禮

本發明涉及一種亞洲型寨卡病毒RT?RIA/CRISPR?Cas12a檢測試劑盒及其檢測方法。所述的試劑盒包括用于亞洲型寨卡病毒RT?RIA/CRISPR?Cas12a檢測的引物和探針序列，所述的引物和探針序列包括寨卡病毒ZIKV和內參基因β?actin基因的RIA引物序列、Cas12a反應crRNA序列和熒光報告探針序列，crRNA序列5’端含有T7啟動子識別位點，ZIKV和β?actin基因熒光報告探針序列5’端標記的熒光基團為FAM、HEX、ROX、VIC、CY5中一種，ZIKV和β?actin基因熒光報告探針序列3’端標記的淬滅基團為TAMRA、MGB、BHQ1和BHQ2中的一種；且探針ZIKV和β?actin的5’端標記的熒光基團均不相同；所述的試劑盒還包括：RIA反應試劑組分；Cas12a反應試劑組分；樣本釋放劑；所述的RIA反應試劑組分包括RIA Buffer、RIA酶和RIA激活劑；所述的Cas12a反應試劑組分包括Cas Buffer和Cas12a酶。

技術領域

本發明涉及檢測技術領域,具體涉及一種亞洲型寨卡病毒RT-RIA/CRISPR-Cas12a檢測試劑盒及其檢測方法。

背景技術

寨卡病毒(Zika Virus，ZIKV)是一種重要的蚊媒病毒，屬黃病毒科，黃病毒屬，基因組為單股正鏈RNA，病毒顆粒直徑40-50nm，傳播媒介為伊蚊。截止2018年3月，全球范圍內共有84個國家報道發現ZIKV感染病例。2016年2月我國確診了中國大陸首例境外輸入性ZIKV感染病例^[1]，隨后在廣東、浙江、北京等地相繼出現輸入性病例^[2]。該病毒在東南亞等地區有逐步蔓延的趨勢。我國南方地區溫暖潮濕極適合蚊子的生長繁殖，導致蚊媒傳染病長期處于高發狀態。世界衛生組織(WHO)認為，新生兒小頭畸形、格林-巴利綜合征(吉蘭-巴雷綜合征)可能與寨卡病毒感染有關^[3]。由于寨卡病毒與登革病毒、西尼羅河病毒和黃熱病毒等其他黃病毒會發生交叉反應，因此通過血清學方法診斷較為困難。建立快速、簡便、靈敏的實驗室核酸檢測方法對及時進行臨床診斷救治、開展流行病學調查具有重要意義。

核酸恒溫擴增技術由于不需反復熱變性，無需特殊儀器，反應速度更快，適合現場快速檢測，在生命科學研究及相關諸多領域已經得到了廣泛應用^[4]。目前已有10余種核酸恒溫擴增技術，其中重組聚合酶擴增(recombinase polymerase amplification，RPA)是2006年由英國公司TwistDx Inc研發的一種核酸恒溫擴增技術^[5]，具有靈敏度高、特異性強、操作快速便捷等優點，而且可以實現定量分析，因此在疾病診斷和病原鑒定等許多領域具有廣闊的應用前景，已在動物疫病檢測如口蹄疫病毒^[6]、小反芻獸疫病毒^[7]、豬細小病毒^[8]、牛病毒性腹瀉^[9]的檢測和病毒性出血熱檢測^[10]如馬爾堡病毒、埃博拉病毒、登革病毒、黃熱病毒和天花病毒的檢測上得到應用。雖然RPA擴增可結合探針進行實時熒光定量PCR檢測，但該方法對引物探針組合篩選要求極高，相較于目前市場上的實時熒光定量PCR方法，并未實質性地提升檢測靈敏度。