[發明專利]γ-聚谷氨酸在植物中異源合成提高植物抗逆性和產量的方法

有效

• 申請號: 202110465460.1
• 申請日: 2021-04-28
• 公開（公告）號: CN113512562B
• 公開（公告）日: 2022-05-17
• 發明（設計）人: 夏濤;馬海珍;李燦
• 申請（專利權）人: 齊魯工業大學
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;C12N15/53;A01H4/00;A01H5/00;A01H5/10;A01H6/46
• 代理公司: 濟南金迪知識產權代理有限公司 37219
• 代理人: 陳桂玲

1.γ-聚谷氨酸在玉米中異源合成提高玉米籽粒中的淀粉含量和直鏈淀粉含量的應用，其中應用步驟是：

(1) 克隆合成γ-聚谷氨酸的基因：從產γ-聚谷氨酸的菌株中克隆合成γ-PGA的3個關鍵酶基因PgsA、PgsB、PgsC；其中，基因PgsA的 GenBank ID: AIA08848.1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；基因PgsB 的Genebank ID: AIA08846.1，其氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示；基因PgsC的Genebank ID: AIA08847.1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；其中，所述產γ-聚谷氨酸的菌株是地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）或解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）；

（2）密碼子優化：按照PgsA、PgsB、PgsC基因的氨基酸序列，通過玉米中的密碼子偏好性分析，人工從頭合成優化后的PgsA、PgsB、PgsC基因；其中，密碼子優化后的PgsA基因核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；密碼子優化后的PgsB基因核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；密碼子優化后的PgsC基因核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

（3）構建植物表達載體：將密碼子優化后的PgsA、PgsB、PgsC基因連入含有bar基因篩選標記的植物表達載體pU130-bar，獲得含有目的基因的植物表達載體，命名為植物表達載體PGA001，該植物表達載體PGA001的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；

（4）獲得玉米籽粒中的淀粉含量和直鏈淀粉含量提高的轉基因玉米的方法是：

1）含植物表達載體PGA001的農桿菌菌株制備

選擇EHA105農桿菌為轉化菌株，在50μl該農桿菌感受態細胞中加入PGA001表達載體3μl，冰浴30分鐘，液氮速凍5分鐘，37℃水浴5分鐘；再加入800-1000μl YEP液體培養基，25-28℃、180-250rpm振蕩培養3小時；取出菌液涂布于含利福平及卡那霉素的固體YEP培養基上，置25-28℃黑暗倒置培養3-4天，取菌落進行菌落PCR驗證，并進行測序，對測序正確的農桿菌保存，用于轉化；

2）愈傷組織的準備

選取玉米自交系KN5585作為受體自交系，取其授粉后10-12d的果穗，去苞葉，在無菌工作臺中，先用70%酒精處理5-6min，再用無菌水沖洗4-5遍，剝取1.5-2 mm的幼胚，盾片向上放置在幼胚誘導培養基上，28℃、黑暗培養誘導愈傷組織；2-3周后將誘導出的愈傷組織，選取生長速度較快、質地松軟、松散易碎、顏色鮮艷的胚性愈傷組織轉移到繼代培養基上繼代培養，每2周繼代一次，用于農桿菌侵染；

3）農桿菌侵染

挑取含有PGA001表達載體的農桿菌單菌落，加入5-6mL的含Kan 的YEP培養基中，培養過夜；室溫下，5000-6000rpm，離心5-10min，收集菌體；將菌體懸浮于含有乙酰丁香酮的侵染液中，并使OD₆₀₀=0.6-0.8，混勻，待用；將制得的侵染液在25-28℃，搖床180rpm活化1-2小時，用于侵染；將玉米的胚性愈傷組織收集在一起放入一個無菌的三角瓶中，然后倒入侵染液，將大的愈傷組織塊打散搖勻，使愈傷組織充分接觸農桿菌，侵染15-20min；將愈傷組織取出，在濾紙上吸干多余的菌液，然后接種到共培養培養基上19-22℃黑暗培養3天；

4）恢復培養

使用含有抗生素的無菌水沖洗愈傷組織表面3-5次，待加入的水不再渾濁時倒掉液體，將愈傷組織轉入鋪有濾紙的平皿中，在超凈臺中吹干愈傷表面水分，轉入恢復培養基，28℃暗培養 7-10 天；

5）篩選培養

恢復培養后將轉化愈傷組織轉入添加有草銨膦的篩選培養基上，篩選培養兩周，然后更換新的篩選培養基25-28℃暗培養 15-20天，將愈傷組織打散再轉入新的篩選培養基繼續篩選，總共篩選2輪，培養30-40天；

6）分化生根

將抗性愈傷組織轉入分化培養基，25-28℃暗培養7-10天，然后轉入光照培養箱25-28℃培養，直至再生芽長至3-5cm時轉入生根培養基；

7）煉苗移栽后自交收種

待長出大量健壯根后，煉苗2-3天，洗凈根部培養基后移栽在滅菌的營養土中，室內煉苗7天后移栽到大田；期間取其幼葉進行PAT/bar蛋白快速檢測試紙條檢測，轉基因陽性玉米自交收獲種子；獲得T1代轉基因玉米植株后，經過兩代嚴格自交，最終獲得轉基因玉米純合株系。