[發明專利]斑馬魚胚胎在刺激性評價中的應用以及刺激性評價方法

有效

• 申請號: 202110461701.5
• 申請日: 2021-04-27
• 公開（公告）號: CN113355385B
• 公開（公告）日: 2022-12-30
• 發明（設計）人: 趙海山;羅小雨;王雅馨;何健華
• 申請（專利權）人: 廣州山海生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02
• 代理公司: 東莞市卓易專利代理事務所(普通合伙) 44777
• 代理人: 萬偉清

本發明涉及刺激性評價技術領域，具體公開了一種斑馬魚胚胎在刺激性評價中的應用以及刺激性評價方法。所述的刺激性評價方法具體采用斑馬魚受精16小時～出殼前的胚胎進行刺激性評價。進一步地，采用斑馬魚受精16小時～出殼前的胚胎采用經皮給藥的方式，結合斑馬魚受精16小時～出殼前的胚胎的痙攣翻滾次數，進行刺激性評價。本發明所述的方法在可以大幅降低假陽性發生的同時還能夠實現對化妝品、藥品或食品的輕微或弱刺激性進行有效的評估；此外，該方法還具有試驗周期短、成本低、尤其是可以高效快速的進行大批量的高通量篩選，且結果準確可靠的優點。

技術領域

本發明涉及刺激性評價技術領域，具體涉及一種斑馬魚胚胎在刺激性評價中的應用以及刺激性評價方法。

背景技術

刺激性物質作用于機體后可能引發機體產生刺激、過敏等一系列的生理、生化反應，其中最主要的是刺激反應，可導致水腫、紅斑、瘙癢、疼痛等癥狀。

藥物、食品、化妝品等都可能對機體產生刺激性；尤其是藥物必須進行刺激性評價；對于化妝品而言，包括歐美國家在內的多國化妝品法規均明確規定了化妝品原料和產品應進行相應的眼睛、皮膚的刺激性安全評價。對于刺激性評價方法，目前常用的方法有如下幾種：

(1)雞胚尿囊膜-絨毛膜試驗，絨毛尿囊膜(CAM)是一個呼吸性膜，包圍在雞胚周圍，因其雞胚尿囊膜表面血管分布豐富，可看作一個完整生物體，通過用一定量的受試品與其接觸，規定時間下觀察其刺激性指標(凝血，出血，血管溶解等)，以評價受試品刺激性情況。作為現如今常用的替代實驗之一，有一定可行優勢，但其在分析結果上常呈現假陽性反應過高等干擾結果的影響因素。且試驗周期相對較長，對實驗模型篩選也有較大限制，且實驗操作精細較為復雜，無法高效快速的進行大批量化妝品/原料藥的高通量篩選。

(2)細胞培養型的熒光素滲漏試驗FL法是一項基于細胞毒性和細胞屏障功能的眼刺激替代試驗。將受試物暴露后，以導致培養的單、多層細胞20％熒光素漏出的受試物的濃度FL20(mg/ml)作為評價指標，若FL20≤100mg/ml，即可確定受試物可導致眼腐蝕性和嚴重刺激性。FL法在國外獲得了大量的驗證研究，OECD指南推薦將FL法用于體外試驗“自上而下”分層組合策略中，初步篩選眼腐蝕性、嚴重刺激性的受試物，但不推薦用于輕微、弱刺激性的評估，以及眼刺激性的分類。FL法僅適用于在規定條件下的水溶性無色物質，不包括強酸、強堿、細胞固定劑、強揮發性物質，會產生凝固、皂化或其他特殊反應的化學物同樣不適用。

(3)離體兔眼法，兔眼試驗在2008年前是測定急性眼刺激的國際標準方法，目前仍是我國化妝品法規中規定的眼刺激性、腐蝕性評價的標準。雖然長期以來，兔眼試驗被認為是評估眼刺激性、腐蝕性的唯一標準方法，但該方法試驗周期長、成本高，且動物試驗結果與人體仍有一定的差異性，其科學性及合理性有待進一步驗證。

綜上所述，現有的刺激性評價方法至少存在如下之一的技術缺陷：試驗周期長、成本高、無法高效快速的進行大批量的高通量篩選、分析結果假陽性反應過高以及對于輕微、弱刺激性無法有效的進行評估。上述技術缺陷是本領域急需解決的技術問題。

發明內容

為了克服背景技術中提到的至少一種技術缺陷，本發明提供了一種使用斑馬魚未出殼胚胎在刺激性評價中的應用以及刺激性評價方法。

本發明所要解決的上述技術問題，通過以下技術方案予以實現：

斑馬魚受精16小時～出殼前的胚胎在刺激性評價中的應用。

優選地，具體通過采用斑馬魚受精16小時～出殼前的胚胎采用經皮給藥的方式，結合斑馬魚受精16小時～出殼前的胚胎的痙攣翻滾次數，進行刺激性評價。