[發(fā)明專利]一種快速篩選CRISPR-Cas9基因組編輯gRNA靶位點(diǎn)的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110461387.0
• 申請(qǐng)日: 2021-04-27
• 公開（公告）號(hào): CN113088559A
• 公開（公告）日: 2021-07-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 畢方鋮;張森;吳少平;胡春華;竇同心;易干軍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所
• 主分類號(hào): C12Q1/66
• 分類號(hào): C12Q1/66;G01N21/64
• 代理公司: 北京慕達(dá)星云知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11465
• 代理人: 崔自京

本發(fā)明公開了一種快速篩選CRISPR?Cas9基因組編輯gRNA靶位點(diǎn)的方法，涉及基因編輯技術(shù)領(lǐng)域，包括以下步驟：(1)在靶標(biāo)基因的不同位置設(shè)計(jì)N個(gè)靶點(diǎn)，分別構(gòu)建基因組編輯載體和LUC融合靶點(diǎn)的表達(dá)載體；(2)測(cè)試LUC融合靶點(diǎn)后載體中雙熒光素酶能正常表達(dá)；(3)將N個(gè)靶點(diǎn)的基因組編輯載體與LUC融合靶點(diǎn)載體共表達(dá)原生質(zhì)體，利用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)測(cè)定原生質(zhì)體LUC和REN的活性，比較N個(gè)靶點(diǎn)LUC/REN的比值，確定最小比值者為最佳靶點(diǎn)。本發(fā)明方法具有靶位點(diǎn)的選擇不受限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的限制，可選擇性廣，且成本低，能夠快速篩選出基因編輯活性高的靶位點(diǎn)進(jìn)行下一步CRISPR?Cas9基因組編輯工作。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因編輯技術(shù)領(lǐng)域，更具體的說(shuō)是涉及一種快速篩選CRISPR-Cas9基因組編輯gRNA靶位點(diǎn)的方法。

背景技術(shù)

目前，基因組編輯技術(shù)，特別是基于CRISPR/Cas9的基因組編輯技術(shù)已廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物基因的功能和分子育種工作。CRISPR/Cas9的基因組編輯主要由Cas9蛋白與sgRNA(single-guide RNA)組成，靶位點(diǎn)通常由20堿基的堿基序列構(gòu)成，靶點(diǎn)的3′端連有PAM序列，Cas9蛋白的PAM序列為NGG，N為任意堿基。Cas9蛋白與gRNA結(jié)合后，先識(shí)別基因組PAM序列，然后通過(guò)gRNA與靶序列DNA鏈互補(bǔ)配對(duì)，完成靶位點(diǎn)的定位過(guò)程，定點(diǎn)后Cas9蛋白在離PAM序列3-4堿基的位置進(jìn)行切割靶點(diǎn)DNA的兩條鏈，從而形成DSB結(jié)構(gòu)，然后細(xì)胞啟動(dòng)自我修復(fù)機(jī)制，在DNA切口處產(chǎn)生堿基丟失、插入或替換，造成基因的突變，實(shí)現(xiàn)對(duì)目的基因精確的編輯。

然而，現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于同一個(gè)基因，不同靶位點(diǎn)產(chǎn)生的基因組編輯效率差異很大；而且，基因組編輯突變的實(shí)現(xiàn)是基于穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系的，對(duì)于植物特別是園藝作物來(lái)說(shuō)，其穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系的效率低，周期長(zhǎng)。如香蕉的遺傳轉(zhuǎn)化周期長(zhǎng)達(dá)1-2年。為了快速高效的得到基因組編輯突變材料，很有必要在進(jìn)行穩(wěn)定的基因組編輯株系創(chuàng)制前，對(duì)不同靶位點(diǎn)的gRNA的編輯突變效率進(jìn)行篩選，挑選高活性的靶位點(diǎn)進(jìn)行穩(wěn)定轉(zhuǎn)化操作。目前，進(jìn)行g(shù)RNA活性檢測(cè)的方法主要兩種：一種是PCR-RE，需要設(shè)計(jì)含有限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的靶位點(diǎn)，這樣使可選擇靶位點(diǎn)的數(shù)量受到很大限制；另一種是PCR擴(kuò)增子高通量二代測(cè)序方法，該方法測(cè)序需委托公司進(jìn)行，價(jià)較昂貴，且測(cè)序周期長(zhǎng)，影響研究進(jìn)展。

因此，提供一種快速篩選高活性基因組編輯gRNA靶位點(diǎn)的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員亟需解決的問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明提供了一種快速篩選高活性基因組編輯gRNA靶位點(diǎn)的方法。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種快速篩選CRISPR-Cas9基因組編輯gRNA靶位點(diǎn)的方法，包括以下步驟：

(1)在靶標(biāo)基因的不同位置設(shè)計(jì)N個(gè)靶點(diǎn)，分別構(gòu)建基因組編輯載體和LUC融合靶點(diǎn)的表達(dá)載體；

(2)測(cè)試LUC融合靶點(diǎn)后載體中雙熒光素酶能正常表達(dá)；

(3)將N個(gè)靶點(diǎn)的基因組編輯載體與LUC融合靶點(diǎn)載體共表達(dá)原生質(zhì)體，利用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)測(cè)定原生質(zhì)體LUC和REN的活性，比較N個(gè)靶點(diǎn)LUC/REN的比值，確定最小比值者為最佳靶點(diǎn)。

將不同靶點(diǎn)的基因組編輯載體與LUC融合靶點(diǎn)載體共表達(dá)原生質(zhì)體后，由于基因組編輯載體的表達(dá)，會(huì)在LUC融合靶點(diǎn)載體中相應(yīng)的靶點(diǎn)位置產(chǎn)生插入或缺失突變，使LUC編碼框移碼，從而產(chǎn)生無(wú)活性的LUC蛋白，進(jìn)一步使檢測(cè)的LUC活性下降，降低LUC/REN的比值。

作為本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案，N≥2。

對(duì)基因組進(jìn)行編輯時(shí)，選擇2個(gè)及以上靶點(diǎn)進(jìn)行篩選，可快速定位編輯活性高的位點(diǎn)，進(jìn)一步利用CRISPR-Cas9基因組編輯技術(shù)，提高育種成功幾率。