[發明專利]一株奈替米星和西索米星單克隆抗體雜交瘤細胞株及其應用

有效

• 申請號: 202110460938.1
• 申請日: 2021-04-27
• 公開（公告）號: CN113136370B
• 公開（公告）日: 2022-10-18
• 發明（設計）人: 胥傳來;雷咸祿;匡華;徐麗廣;馬偉;劉麗強;吳曉玲;宋珊珊;胡擁明
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N5/20
• 分類號: C12N5/20;C07K16/44;C07K14/765;C07K1/107;C07K1/34;G01N33/577;C07H15/26;C07H1/00
• 代理公司: 無錫華源專利商標事務所(普通合伙) 32228
• 代理人: 嚴梅芳

一株奈替米星和西索米星單克隆抗體雜交瘤細胞株及其應用，屬于食品安全免疫檢測領域。本發明公開了一株奈替米星和西索米星單克隆抗體雜交瘤細胞株HLQ 3C9，分類命名為單克隆細胞株，保藏日期2020年9月27日，保藏編號CGMCC No.20788。本發明將奈替米星的完全抗原與等量弗氏佐劑混合乳化，通過頸背部皮下多點注射免疫BALB/c小鼠。將高效價，低IC₅₀小鼠的脾細胞，通過PEG方法與小鼠骨髓瘤細胞融合，篩選出融合后的雜交細胞；經過間接競爭酶聯免疫法篩選細胞并三次亞克隆，最終得到一株單克隆抗體雜交瘤細胞株。此細胞株分泌的單克隆抗體，對奈替米星和西索米星均具有較好的特異性和檢測靈敏度，為食品中奈替米星和西索米星殘留的免疫檢測提供了原料，具有實際應用價值。

技術領域

本發明涉及一株奈替米星和西索米星單克隆抗體雜交瘤細胞株及其應用，屬于食品安全免疫檢測領域。

背景技術

奈替米星(Netilmicin，NTM)是以西索米星(Sisomicin，SSM)為原料合成的一種氨基糖苷類廣譜抗生素，具有與慶大霉素類似的抗菌譜和臨床療效。它具有對氨基糖苷乙酰轉移酶AAC(3)穩定的特點，對大多數革蘭氏陰性細菌和許多革蘭氏陽性細菌包括金黃色葡萄球菌特別有效，對其他氨基糖苷類藥物如慶大霉素、西索米星和妥布霉素耐藥菌株均有活性，其耳毒性和腎毒性均低于其他氨基糖苷類藥物。它是治療嚴重細菌感染的一線抗菌藥物之一，常用于呼吸系統感染、皮膚軟組織感染、泌尿系統感染、創面感染、骨關節感染、產后感染、胃腸道及膽道感染、敗血癥等。然而，與其他氨基糖苷類一樣，奈替米星的治療指數相對較窄，并且很難被機體代謝掉，而西索米星有耳毒性和腎毒性，過量使用或長時間低劑量接觸會危害人體健康。因此，有必要對該藥物在血清和尿液中進行監測，以避免毒性，并優化抗生素劑量。

此外，奈替米星和西索米星還被用作添加劑和獸藥用于畜牧業中動物疾病的預防和治療，而人類通過飲食長時間暴露這些藥物，也會對身體健康造成傷害。我國農業部第560號公告規定廢止獸藥硫酸奈替米星，這對奈替米星和西索米星的檢測提出了要求。由于奈替米星和西索米星的極性堿性和缺乏強烈的吸收紫外線的發色團，想直接分析并不簡單。目前，除了美國藥典和歐洲藥典推薦的微生物法，近年來也開發了以液相色譜為主的儀器檢測方法，但這些方法較為專業性高、耗時長和成本高。隨著近年來免疫分析技術的快速發展，建立一種針對NTM和SSM的高效、快速的免疫檢測方法成為可能，包括酶聯免疫法(ELISA)、膠體金免疫層析試紙條技術和免疫磁珠技術等。而這些方法建立的一個重要前提即需篩選出針對奈替米星和西索米星的高特異性單克隆單體。

發明內容

本發明的目的是提供一株奈替米星和西索米星單克隆抗體雜交瘤細胞株及其應用，由該細胞株制備的抗體對奈替米星和西索米星具有較好特異性和檢測靈敏度，可以用來建立奈替米星和西索米星的免疫學檢測方法。

本發明的技術方案如下：一株奈替米星和西索米星單克隆抗體雜交瘤細胞株HLQ3C9，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，分類命名為單克隆細胞株，保藏日期2020年9月27日，保藏編號CGMCC No.20788。

一種奈替米星和西索米星單克隆抗體，其由所述保藏編號為CGMCC No.20788的雜交瘤細胞株HLQ 3C9分泌產生。

奈替米星人工抗原﹙半抗原﹚，分子式如下：

簡稱NTM-1。

奈替米星人工抗原的制備方法，將西索米星先乙酰化制得三乙酰西索米星，再進行三甲基硅烷化保護羥基，然后與4-溴丁酸乙酯反應，最后堿水解、分離純化制備得到奈替米星人工抗原。

合成路線如下：

具體步驟為：