[發明專利]一種胰島體外培養表面雜細胞處理方法

在審

• 申請號: 202110460519.8
• 申請日: 2021-04-27
• 公開（公告）號: CN113308433A
• 公開（公告）日: 2021-08-27
• 發明（設計）人: 彭園征;王慈慈;周明;歐映廷
• 申請（專利權）人: 立沃生物科技（深圳）有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 深圳市中科創為專利代理有限公司 44384
• 代理人: 徐方星;王建成

本發明公開一種胰島體外培養表面雜細胞處理方法，具體為向培養胰島的胰島培養基中加入適當濃度的碘乙酸并培養一段時間。本發明利用了碘乙酸對細胞膜有極強的破壞作用以及碘乙酸對細胞糖酵解作用的抑制能力，通過對培養基中的碘乙酸濃度的調節、處理時間的控制，來處理胰島表面的雜細胞(尤其是成纖維細胞)，從而減少后續實驗步驟，減少細胞損傷。

技術領域

本發明涉及細胞培養技術領域，尤其涉及一種胰島體外培養表面雜細胞處理方法。

背景技術

胰島是指分布于胰腺外分泌部的腺泡間的內分泌細胞團。胰島表面包被一層由薄層網狀纖維組成的被膜，但不同的物種被膜并不一定完全。胰島可以通過膠原酶熱消化胰腺并結合密度梯度離心純化操作來獲取。即通過胰管往胰腺中灌注適量濃度的膠原酶溶液，然后摘取灌注起來的胰腺浸泡到膠原酶溶液，37℃水浴孵育一定時間使胰腺被膠原酶消化成細砂狀，終止膠原酶的消化作用后，進行密度梯度離心法初步純化出胰島，可通過手挑胰島進行二次純化來獲取極高純度的胰島。為了獲取高活性的完整胰島，膠原酶消化時間不宜過長，因此，純化出的胰島表面一般會含有少量的雜細胞，包括成纖維細胞、腺泡細胞及導管細胞等。

成纖維細胞等雜細胞都比胰島(細胞)貼壁生長迅速，過多增長的雜細胞顯著影響胰島體外培養的貼壁、生長狀態，同時，也不利于對胰島的研究工作的開展。因此，如何有效的抑制雜細胞(尤其是成纖維細胞)的增長對胰島體外培養非常重要。多次轉板培養可以較好的減少雜細胞的比例，但操作比較費時費力，不適合大規模體外培養胰島，且密集的操作也會對胰島的生長狀態造成很大的不利影響。

因此，現有技術存在缺陷，需要改進。

發明內容

本發明要解決的技術問題是：提供一種胰島體外培養表面雜細胞處理方法，去除雜細胞對胰島的影響。

本發明的一個技術方案如下：提供一種胰島體外培養表面雜細胞處理方法，包括：以下步驟；

S1：將層粘連蛋白鋪在培養容器中，確保層粘連蛋白溶液均勻地分布在表面上，然后放到CO₂培養箱孵育。

S2：挑選待培養的分離純化后的胰島鋪到孵育后的層粘連蛋白上。

S3：向培養容器中加入含0.5ng/ml-1μg/ml碘乙酸的胰島培養基，培養0.5h-120h。

S4：培養結束后，去除含0.5ng/ml-1μg/ml碘乙酸的胰島培養基，便獲得純凈胰島。

碘乙酸可以破壞雜細胞以及胰島中的細胞的細胞膜，但由于胰島為團聚在一起的細胞團，因此通過調節碘乙酸的濃度和培養的時間，使得雜細胞被破壞后，胰島表面的細胞也被破壞，但胰島中的大部分細胞仍然存活，依然為胰島，因此提高了胰島的純度，方便對胰島的后續操作。

所述胰島培養基是在RPMI 1640培養基中添加以下成分：1.2g/L葡萄糖、10mmol/LHEPES、10mg/L丙酮酸鈉，10％v/v胎牛血清、1％v/v青-鏈霉素；RPMI 1640培養基可市售購買，如購自美國sigma公司，貨號為R1383；上述的葡萄糖可市售購買，如購自美國sigma公司，貨號為G7021；上述的HEPES可市售購買，如購自美國sigma公司，貨號為V900477；上述的丙酮酸鈉可市售購買，如購自美國sigma公司，貨號為P5280；上述胎牛血清可市售購買，如購自以色列BIOLOGICAL INDUSTRIES公司，貨號為REF03-031-1B；上述青-鏈霉素可市售購買，如購自以色列BIOLOGICAL INDUSTRIES公司，貨號為04-001-1ACS。

在步驟S1中，層粘連蛋白基質不能變干。

步驟S2中的分離純化后的胰島為通過消化胰腺并經過純化操作后得到的細胞團，在挑選前，先在CO₂培養箱培養過夜，讓胰島在分離純化時受到的損傷得到調節、恢復。