[發明專利]黑木耳凝集素的提取方法

在審

• 申請號: 202110457511.6
• 申請日: 2021-04-27
• 公開（公告）號: CN112961228A
• 公開（公告）日: 2021-06-15
• 發明（設計）人: 張彥龍;曾偉民;趙丹丹;雷虹;黃東;馬成瑤
• 申請（專利權）人: 黑龍江大學
• 主分類號: C07K14/375
• 分類號: C07K14/375;C07K1/14;C07K1/34
• 代理公司: 哈爾濱市文洋專利代理事務所(普通合伙) 23210
• 代理人: 何強

黑木耳凝集素的提取方法，它涉及一種黑木耳凝集素的提取方法。本發明是為了提供一種黑木耳凝集素的提取方法。本方法：一、制備黑木耳凝集素粗提液3MTHS1?0；二、制備上清液3MTHS1?1；三、解離；四、制備溶液3MTHS1?2；五、制備提取液1；六、制備提取液2；七、將提取液1、提取液2和溶液3MTHS1?2合并，進行5kDa超濾除鹽，凝縮至2mL，再用10kDa的超濾離心管以4400r/min繼續超濾至0.5mL，超濾過程中加水除鹽3次，冷凍干燥，即得黑木耳凝集素。本發明提取的黑木耳凝集素對RAW264.7細胞無細胞毒性，而且可以提高RAW264.7細胞的增殖活性、核酸代謝活性和吞噬能力。具有免疫調節活性。本發明屬于凝集素的提取領域。

技術領域

本發明涉及一種黑木耳凝集素的提取方法。

背景技術

黑木耳是常見的食用菌,不僅營養豐富,還具有眾多的生物活性。近年來對黑木耳多糖研究較多,對于其他成分研究較少，凝集素(Lectin)是指一種從各種植物，無脊椎動物和高等動物中提純的糖蛋白或結合糖的蛋白，因其能凝集紅血球(含血型物質)，故名凝集素。常用的為植物凝集素(Phytoagglutin，PNA)，通常以其被提取的植物命名。凝集素是動物細胞和植物細胞都能夠合成和分泌的、能與糖結合的蛋白質，在細胞識別和粘著反應中起重要作用，主要是促進細胞間的粘著。凝集素具有一個以上同糖結合的位點，因此能夠參與細胞的識別和粘著，將不同的細胞聯系起來。

發明內容

本發明的目的是為了提供一種黑木耳凝集素的提取方法。

黑木耳凝集素的提取方法按照以下步驟進行：

一、稱取干燥的黑木耳5g，加入100m L的磷酸鹽緩沖液，在搗碎機中充分攪碎至粘稠的勻漿，每5min攪碎2次，兩次之間將黑木耳勻漿放入冰浴中制冷3min，將黑木耳勻漿以5000r/min冷凍離心30min，收集上清液后采用四層FN 15膜高壓過濾，濾液為黑木耳凝集素粗提液3MTHS1-0；

二、將25mL 3MTHS1-0與25mL豬胃粘蛋白II型-溴化氰活化的瓊脂糖凝膠4B充分混合，于6℃攪拌過夜，次日以3000r/min離心5min，得到上清液3MTHS1-1；

三、將步驟二離心后的下層液分別用10mL PBS緩沖液洗三次，以3000r/min離心速率離心5min，棄去上清液；

四、解離：向步驟三所得的溶液中加入10mL甘氨酸濃度為0.1mol/L、NaCl濃度為1mol/L、pH值為3.0的溶液，充分搖勻10min，以3000r/min離心速率離心5min，在得到的上清中加入Tris-HCl緩沖溶液；

五、重復步驟四三次，并將三次得到的溶液合并，得到溶液3MTHS1-2；

六、向步驟四中棄去上清液后的溶液中加入2ml濃度為1mol/L、pH值為7.8的Tris-HCl緩沖溶液和25mL PBS緩沖溶液，以3000r/min離心5min，清洗2次；

七、將3MTHS1-1按照步驟二-步驟五的步驟重復提取，得到提取液1；

八、將3MTHS1-0按照步驟二-步驟五的步驟重復提取，得到提取液2；

九、將提取液1、提取液2和溶液3MTHS1-2合并，進行5kDa超濾除鹽，凝縮至2mL，再用10kDa的超濾離心管以4400r/min繼續超濾至0.5mL，超濾過程中加水除鹽3次，冷凍干燥，即得黑木耳凝集素。

步驟一中所述磷酸鹽緩沖液濃度為10mmol/L、pH值為7.6。

步驟四中按照每10mL上清中加入1mL Tris-HCl緩沖溶液的比例加入Tris-HCl緩沖溶液。

步驟四中所述Tris-HCl緩沖溶液濃度為1mol/L、pH值為7.8。