[發明專利]一種用于檢測路易體病標志物的Cas12a-DNAzyme傳感器及其制備方法

有效

• 申請號: 202110456485.5
• 申請日: 2021-04-27
• 公開（公告）號: CN113186253B
• 公開（公告）日: 2022-06-21
• 發明（設計）人: 陳憲;文俊梅
• 申請（專利權）人: 福州大學
• 主分類號: C12Q1/682
• 分類號: C12Q1/682;C12Q1/6825;G01N21/64
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

1.一種用于檢測路易體病標志物的Cas12a-DNAzyme傳感器，其特征在于，包括以下組分：DNAzyme和Locker雜交鏈D-L溶液；sub-1和sub-2雜交鏈sub1-2溶液；發夾H溶液；含LbCas12a、crRNA 和ssDNA-FQ的報告器溶液；和目標物溶液；

用于組裝Cas12a-DNAzyme傳感器的DNA序列包括以下序列：

DNAzyme:5'-GGCGGTACCAGGTCAAAGGTGGGTGAGGGGACGCCAAGAGTCCCCGCGGTTAGATAGACCGTTCGCG-3'；

Locker:5'-GGTGGCTGGAGGGGGCGCGAACGGTCTAT-3'；

Sub-1:5'-TTTGCAGTATCAGTCTATCTAT/rA/GGAAGTACCGCCGTACTGCAAACTGGGTGTGTCGTCTGGTTGGGTG-3'；

Sub-2:5'-TTTGCAGTATCAGTCTATCTAT/rA/GGAAGTACCGCCGTACTGCAAACGACCAACCCAGCACCCAACCAGA-3'；

發夾H:5'-ATCAGTCTATGCAATAGATAGACTGATACTGCAAA-3'；

ssDNA-FQ:5'-Cy3-TTATT-BHQ2-3'；

所述crRNA序列為：5'-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCAGUAUCAGUCUAUCUAU-3'。

2.如權利要求1所述一種用于檢測路易體病標志物的Cas12a-DNAzyme傳感器的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）將DNAzyme和Locker分別溶于緩沖液B中得到終濃度為100μM的溶液；分別取100μM的DNAzyme和Locker的溶液各1μL，溶于48 μL的緩沖液B中，混勻后于95 oC加熱5 min，自然冷卻至室溫，得到DNAzyme和Locker的雜交鏈D-L溶液，稱為混合物1；

（2）將α-syn寡聚體溶于緩沖液A中制備成目標物溶液；向混合物1加入目標物溶液，于37 oC反應2 h，得到混合物2；

（3）將sub-1和sub-2分別溶于緩沖液B中得到濃度為100 μM的溶液；將sub-1溶液和sub-2溶液分別于95 oC加熱5 min，自然冷卻至室溫；然后取退火后的100 μM的sub-1溶液和sub-2溶液各1 μL，溶于48 μL的緩沖液B中，混勻后在室溫反應2 h，得到sub-1和sub-2的雜交鏈sub1-2溶液，稱為混合物3；

（4）將發夾H溶于緩沖液B中得到濃度為100 μM的溶液；將2 μM的發夾H經95 oC加熱5min并自然冷卻至室溫；分別取10 μL退火后的2 μM發夾H、混合物2、混合物3，混勻后于30 oC反應2 h，得到含有目標物的混合物4；

（5）各取10 μL濃度均為500 nM的LbCas12a和crRNA混勻，25 oC反應30 min，再加入50μL的濃度為1 μM的ssDNA-FQ，混勻后得到報告器溶液；

（6）將70 μL的報告器溶液和30 μL的混合物4混勻后于37 oC避光反應2 h，得到總體積為100 μL的待測溶液；在525 nm的激發光波長下測量并記錄樣品在540?650 nm范圍內的熒光強度。

3.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述緩沖液A成分為：0.24% Tris-0.87% NaCl，pH = 7.4，0.2 μm濾膜過濾；緩沖液B成分為：200 mM NaCl，100 mM Tris-HCl，pH = 7.4。