[發(fā)明專利]一種群體感應(yīng)型雙向調(diào)控系統(tǒng)及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110453615.X
• 申請(qǐng)日: 2021-04-26
• 公開（公告）號(hào): CN113073108B
• 公開（公告）日: 2022-10-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 史鋒;劉海艷;李永富
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/77
• 分類號(hào): C12N15/77;C12N15/113;C12N15/31;C12R1/15
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠(yuǎn)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 23211
• 代理人: 仇鈺瑩

本發(fā)明公開了一種群體感應(yīng)型雙向調(diào)控系統(tǒng)及其應(yīng)用，屬于基因工程領(lǐng)域。本發(fā)明中的群體感應(yīng)正調(diào)控系統(tǒng)可以自誘導(dǎo)性地上調(diào)靶基因，激活倍數(shù)達(dá)到6.35倍。本發(fā)明中的群體感應(yīng)負(fù)調(diào)控系統(tǒng)可以自誘導(dǎo)性地下調(diào)靶基因，抑制率達(dá)到36～96％。本發(fā)明篩選得到18種不同強(qiáng)度的群體密度依賴性啟動(dòng)子P_srfAM，其表達(dá)強(qiáng)度為天然型P_srfA啟動(dòng)子的0.4–1.5倍。本發(fā)明中的群體感應(yīng)雙向動(dòng)態(tài)調(diào)控系統(tǒng)可以同時(shí)自誘導(dǎo)性地上調(diào)和下調(diào)不同或相同的靶基因的表達(dá)。將篩選得到的群體密度依賴性突變型啟動(dòng)子應(yīng)用于群體感應(yīng)型自誘導(dǎo)系統(tǒng)，能更加靈活且自誘導(dǎo)性的調(diào)控谷氨酸棒桿菌中目標(biāo)基因的表達(dá)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種群體感應(yīng)型雙向調(diào)控系統(tǒng)及其應(yīng)用，屬于基因工程領(lǐng)域。

背景技術(shù)

谷氨酸棒桿菌是公認(rèn)的一種食品安全級(jí)的生產(chǎn)菌株，應(yīng)用于氨基酸、有機(jī)酸、醇類、蛋白質(zhì)等70余種產(chǎn)品的生物制造，產(chǎn)值超過千億元。對(duì)于谷氨酸棒桿菌，傳統(tǒng)的遺傳改造策略主要為基因過表達(dá)、敲除等，這些手段能一定程度改善菌株的生產(chǎn)性能，但是有一定限度，并且會(huì)影響菌株生長(zhǎng)，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)造成負(fù)擔(dān)。近年來，一些合成生物工具逐漸應(yīng)用于谷氨酸棒桿菌的動(dòng)態(tài)調(diào)控和代謝工程改造，如支鏈氨基酸和甲硫氨酸生物傳感器Lrp-P_brnFE，賴氨酸生物傳感器LysG-P_lysE，莽草酸生物傳感器ShiR-P_shiA等，然而谷氨酸棒桿菌中這類內(nèi)源性的動(dòng)態(tài)調(diào)控元件很有限。因此，尋找新的能夠適用于谷氨酸棒桿菌的動(dòng)態(tài)調(diào)控元件是很有必要的。

群體感應(yīng)系統(tǒng)是生物中一種隨細(xì)胞密度增加而調(diào)節(jié)基因表達(dá)的自誘導(dǎo)系統(tǒng)，它不需要添加外源誘導(dǎo)物，而是利用細(xì)胞自身分泌的自誘導(dǎo)物。自誘導(dǎo)物的類型主要有三類：革蘭氏陰性菌分泌的高絲氨酸內(nèi)脂 (AHLs)、革蘭氏陽性菌分泌的自誘導(dǎo)肽(AIP)和介導(dǎo)革蘭氏陰性菌與陽性菌種間交流的AI-2。來源于一種革蘭氏陽性菌枯草芽孢桿菌的ComQXPA群體感應(yīng)系統(tǒng)的自誘導(dǎo)物屬于AIP分子類型。該系統(tǒng)由 comX、comQ、comP和comA共4個(gè)基因組成，其中comX編碼具有55個(gè)氨基酸殘基的前導(dǎo)肽(Pre-ComX)，該前導(dǎo)肽再經(jīng)comQ基因的編碼產(chǎn)物異戊二烯轉(zhuǎn)移酶ComQ的修飾處理，產(chǎn)生由其C末端10個(gè)氨基酸殘基組成的、具有活性的類異戊二烯類多肽信息素ComX。隨著細(xì)菌的生長(zhǎng)和群體密度的增加，釋放到胞外的信息素分子ComX不斷積累。當(dāng)達(dá)到一定閾值時(shí)，信息素ComX就與跨膜蛋白組氨酸激酶ComP結(jié)合，并激活該酶，促進(jìn)其發(fā)生自磷酸化。磷酸化的ComP隨后將磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移給ComA調(diào)控蛋白，并激活該蛋白。被激活的ComA蛋白進(jìn)而結(jié)合在下游靶基因的啟動(dòng)子上并激活下游靶基因的表達(dá)，而P_srfA是ComQXPA 系統(tǒng)的靶啟動(dòng)子之一。

小分子調(diào)控RNA(small regulatory RNA，sRNA)是一類序列長(zhǎng)度為50-200個(gè)核苷酸的非編碼RNA，主要作為調(diào)控因子維持翻譯和信息傳遞穩(wěn)定。其中一類sRNA形成二級(jí)結(jié)構(gòu)招募RNA分子伴侶Hfq，通過堿基配對(duì)方式靶向mRNA，促進(jìn)sRNA與mRNA之間雜交，抑制翻譯。同時(shí)，Hfq招募核糖核酸酶E (RNAseE)加速mRNA降解。因此，hfq-sRNA系統(tǒng)可以抑制基因表達(dá)。馬延和等研究者將hfq-sRNA系統(tǒng)引入到谷氨酸棒桿菌中，負(fù)調(diào)控綠色熒光蛋白基因gfp的表達(dá)，其抑制率為86.7％，將該系統(tǒng)進(jìn)一步應(yīng)用于谷氨酸合成途徑中其他基因的抑制調(diào)控，提高了代謝產(chǎn)物谷氨酸的產(chǎn)量。將hfq-sRNA系統(tǒng)與群體感應(yīng)系統(tǒng)相偶聯(lián)，從而開發(fā)一套適用于谷氨酸棒桿菌的自誘導(dǎo)性下調(diào)系統(tǒng)，將會(huì)更好地服務(wù)于谷氨酸棒桿菌的代謝工程改造。

將群體感應(yīng)系統(tǒng)運(yùn)用于代謝工程，無需添加誘導(dǎo)物就可以自動(dòng)調(diào)節(jié)基因表達(dá)，是一種經(jīng)濟(jì)且較理想的技術(shù)手段。目前文獻(xiàn)報(bào)道中已有多種群體感應(yīng)系統(tǒng)被開發(fā)出來并應(yīng)用于大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母等的代謝工程調(diào)控。然而在谷氨酸棒桿菌中群體感應(yīng)調(diào)控元件的開發(fā)和應(yīng)用仍然處于空白。因此，改造異源的群體感應(yīng)自誘導(dǎo)系統(tǒng)并將其引入谷氨酸棒桿菌中是一個(gè)很好的基因回路改造策略，能夠豐富谷氨酸棒桿菌的動(dòng)態(tài)調(diào)控元件類型，并促進(jìn)谷氨酸棒桿菌的代謝工程改造。因此，如何獲得谷氨酸棒桿菌可用的、有效的群體感應(yīng)自誘導(dǎo)工具、實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)的自動(dòng)動(dòng)態(tài)調(diào)控仍然是一個(gè)重要的技術(shù)問題。