[發(fā)明專利]一種香蕉枯萎病菌的單孢分離方法

有效

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• 申請日: 2021-04-19
• 公開（公告）號: CN112941007B
• 公開（公告）日: 2022-06-17
• 發(fā)明（設計）人: 王忠文;張君成;張容博
• 申請（專利權）人: 廣西大學
• 主分類號: C12N3/00
• 分類號: C12N3/00;C12N1/14;C12N1/02;C12M1/26;C12R1/77
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1.一種香蕉枯萎病菌（Fusarium oxysporum f .sp .Cubense）的單孢分離方法，其特征是，采用一種特殊的孢子抹散絲直接從香蕉枯萎病菌菌落中，將單個分生孢子分離出來，培養(yǎng)形成一個遺傳組成單一的香蕉枯萎病菌菌株，分離培養(yǎng)的操作步驟如下：

1)香蕉枯萎病菌產孢菌落的準備：將常規(guī)分離培養(yǎng)取得的香蕉枯萎病菌移植到常規(guī)培養(yǎng)基平板，常規(guī)培養(yǎng)獲得香蕉枯萎病菌的產孢菌落；

2)孢子抹散絲的制備：取出10μl普通移液槍的槍頭，將槍頭的尖端放在火焰上灼燒，槍頭尖端燃火處熔化，安全熄火后，用尖頭鑷子夾住一點熔化的槍頭，輕輕拉長，至形成一根發(fā)絲狀的細絲，冷卻后剪去多余的細絲，形成一支分離香蕉枯萎病菌分生孢子使用的孢子抹散絲，該抹散絲包括滑動絲(a)、絲柄(b)部分；

3)孢子抹散板的制備：

①瓊脂平板基質的制備：按照瓊脂15g、水1000ml的配比，配制含有常規(guī)營養(yǎng)的瓊脂基質，常規(guī)高溫高壓滅菌后，成為瓊脂平板基質備用；

②瓊脂平板的倒制與平板表層凈化：將操作①制備的瓊脂平板基質加熱充分熔化，趁熱倒入培養(yǎng)皿制成薄層平板，并將該熱液狀的平板置于能繼續(xù)保持熱液狀的保溫裝置內，保溫靜置20分鐘以上，然后將該靜置的液狀薄層平板，平穩(wěn)轉移到無菌工作臺面，待液狀薄層平板冷凝后，成為表層凈化的瓊脂平板；

③孢子抹散板的切制與裝片：用滅菌刀片將操作②制成的瓊脂平板，切割成長條狀的瓊脂條塊，該瓊脂條塊就是起分散孢子作用的抹散板；用滅菌刀片將該抹散板挑起裝放到滅菌載玻片上，成為備待分散孢子用的抹散板(c)；

4)分生孢子的抹散：將步驟2)制備的孢子抹散絲進行常規(guī)表面消毒和清潔，然后手執(zhí)孢子抹散絲的絲柄(b)，將滑動絲(a)的端部，在步驟1)準備的產孢菌落上，輕輕點觸菌落而粘附分生孢子，將粘有孢子的滑動絲(a)轉移到步驟3)準備的孢子抹散板(c) 的一端，并貼放于抹散板面上，沿著抹散板面滑移滑動絲(a)，滑動絲(a)在抹散板面的相對滑抹，導致滑動絲(a)上粘附的孢子脫開散落在抹散板面上；

5)鏡檢尋找單孢子：將步驟4)得到的載有分生孢子的抹散板(c)，置于顯微鏡下觀察，沿著滑動絲(a)的滑動軌跡尋找離散的孢子，找出單一出現的孢子，選擇與左右相鄰孢子間隔距離遠的單一孢子；

6)載有單孢子小方塊的切取：將步驟5)鏡檢選擇的單一孢子移到顯微鏡視野中間，用滅菌刀片將該單一孢子左右的抹散板(c)切斷及移開，得到只載有唯一1個分生孢子的小方塊；

7)單孢子分離菌株的形成：用刀片將步驟6)切出的載有單一分生孢子的小方塊，轉移到香蕉枯萎病菌的常規(guī)培養(yǎng)基上，常規(guī)培養(yǎng)，直到孢子萌發(fā)生長形成單孢子菌落；移植單孢子菌落的菌絲擴大繁殖，形成香蕉枯萎病菌單孢子分離菌株。