[發(fā)明專利]一種免擴(kuò)增核酸檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110450385.1
• 申請(qǐng)日: 2021-04-25
• 公開（公告）號(hào): CN113215222B
• 公開（公告）日: 2023-06-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 余輝;曾強(qiáng);楊玉婷
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海交通大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/6834
• 分類號(hào): C12Q1/6834;C12Q1/682;G01N21/552
• 代理公司: 上海科盛知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31225
• 代理人: 蔣亮珠

本發(fā)明涉及一種免擴(kuò)增核酸檢測(cè)方法，該方法包括以下步驟：1)通過在金膜表面進(jìn)行修飾得到的免擴(kuò)增核酸檢測(cè)傳感芯片；2)以金納米顆粒作為報(bào)告分子與待檢測(cè)樣品，加入所述免擴(kuò)增核酸檢測(cè)傳感芯片的反應(yīng)腔；3)通過波矢耦合搭建的具有無標(biāo)記實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)能力的表面等離子共振成像系統(tǒng)SPRi，實(shí)現(xiàn)對(duì)核酸的免擴(kuò)增單顆粒檢測(cè)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明通過對(duì)單分子雜交過程的動(dòng)態(tài)檢測(cè)和數(shù)字化分析，極大提高核酸檢測(cè)的靈敏度，解決了核酸擴(kuò)增易受氣溶膠污染、假陽性高的問題。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物傳感器領(lǐng)域，涉及一種基于表面等離子共振顯微成像技術(shù)的免擴(kuò)增核酸檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

分子診斷技術(shù)相較于其他技術(shù)具有快速、高靈敏、高特異性等優(yōu)勢(shì)，是體外診斷技術(shù)最重要的發(fā)展和研究方向。核酸檢測(cè)作為分子診斷技術(shù)的一項(xiàng)重要應(yīng)用發(fā)揮著越來越重要的作用，截至2020年12月3日，中國國家藥品監(jiān)督管理局已批準(zhǔn)的53個(gè)新冠病毒檢測(cè)試劑中就包含25個(gè)核酸檢測(cè)試劑，可見核酸的單分子檢測(cè)仍是目前應(yīng)用最廣，實(shí)用性最高的技術(shù)。如何提高核酸分子檢測(cè)的速度、靈敏度和特異性，是提高重大疾病診斷能力的重點(diǎn)和難點(diǎn)問題。

目前的核酸檢測(cè)技術(shù)多采用靶標(biāo)擴(kuò)增(target-amplification)的策略來實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)核酸分子的超靈敏檢測(cè)。其本質(zhì)是一種終點(diǎn)檢測(cè)，即將待測(cè)分子與試劑(酶，引物和底物等)充分反應(yīng)后對(duì)擴(kuò)增后的核酸分子進(jìn)行信號(hào)檢測(cè)，靈敏度和特異性均受分子結(jié)合動(dòng)力學(xué)的限制。如圖1所示，Ligand/Target?molecule為配體目標(biāo)分子，Receptor為受體，Non-specific?binding為非特異性結(jié)合的分子，specific?binding為特異性結(jié)合的分子，在分子雜交或免疫反應(yīng)達(dá)到平衡狀態(tài)時(shí)，發(fā)生結(jié)合的分子數(shù)取決于可結(jié)合位點(diǎn)數(shù)、樣品濃度以及親和力，因此當(dāng)樣品濃度降低到一定程度時(shí)，發(fā)生結(jié)合的分子數(shù)將不足1個(gè)，即使采用最先進(jìn)的單分子檢測(cè)技術(shù)，也將無法穩(wěn)定檢測(cè)到信號(hào)。該臨界濃度即理論靈敏度極限，通常在100fM量級(jí)，同時(shí)由于背景噪聲的存在無法達(dá)到單分子檢測(cè)，導(dǎo)致在實(shí)際應(yīng)用中的檢測(cè)限通常在pM或pg/mL級(jí)，無法對(duì)更低豐度的重要生物分子進(jìn)行檢測(cè)。另一方面，雖然通常情況下特異性結(jié)合的親和力要遠(yuǎn)高于非特異性結(jié)合，但在實(shí)際檢測(cè)中，樣品中干擾分子的濃度通常遠(yuǎn)高于待測(cè)分子，使得平衡狀態(tài)下非特異性結(jié)合的分子數(shù)量變得不可忽略，造成假陽性結(jié)果。因此，在核酸檢測(cè)中，首先需要采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR技術(shù)進(jìn)行核酸擴(kuò)增，將樣品濃度提高，通過熒光強(qiáng)度變化檢測(cè)產(chǎn)物濃度的變化，這通常需要長時(shí)間的核酸提取和擴(kuò)增步驟，如在新冠病毒檢測(cè)中，核酸檢測(cè)通常需要數(shù)個(gè)小時(shí)才能得到結(jié)果。從原理上來說，PCR技術(shù)并沒有突破分子結(jié)合動(dòng)力學(xué)的限制，也無法解決特異性的問題。最后，基于擴(kuò)增策略還存在一個(gè)不容忽視的問題-氣溶膠污染，PCR技術(shù)的高擴(kuò)增效率產(chǎn)生的核酸氣溶膠污染，會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果的假陽性，樣本和擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)常出現(xiàn)多批次相同的情況，核酸氣溶膠污染在實(shí)驗(yàn)區(qū)域內(nèi)不斷累積，日積月累從而導(dǎo)致污染風(fēng)險(xiǎn)不斷增加，假陽性的發(fā)生頻率也越來越高。因此，開發(fā)一種無擴(kuò)增的超靈敏的核酸檢測(cè)裝置成了分子診斷領(lǐng)域的一個(gè)迫切需要解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷而提供一種突破終點(diǎn)檢測(cè)極限實(shí)現(xiàn)超靈敏檢測(cè)，無需擴(kuò)增，大大縮短檢測(cè)時(shí)間且從根本上解決了氣溶膠污染的免擴(kuò)增核酸檢測(cè)方法。

本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：一種免擴(kuò)增核酸檢測(cè)方法，該方法包括以下步驟：

1)通過在金膜表面進(jìn)行修飾得到的免擴(kuò)增核酸檢測(cè)傳感芯片；

2)以金納米顆粒作為報(bào)告分子與待檢測(cè)樣品，加入所述免擴(kuò)增核酸檢測(cè)傳感芯片的反應(yīng)腔；

3)通過波矢耦合搭建的具有無標(biāo)記實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)能力的表面等離子共振成像系統(tǒng)SPRi，實(shí)現(xiàn)對(duì)核酸的免擴(kuò)增單顆粒檢測(cè)。

進(jìn)一步地，所述的免擴(kuò)增核酸檢測(cè)傳感芯片通過以下方法獲得：

a)在光學(xué)玻璃上利用磁控濺射法先鍍3～9nm的鉻Cr，再鍍27～61nm的金Au，得到30～70nm厚度的鍍膜表面；