[發明專利]一種蠟樣芽胞桿菌高產麥芽五糖α-淀粉酶的突變體及其應用

有效

• 申請號: 202110443809.1
• 申請日: 2021-04-23
• 公開（公告）號: CN113151327B
• 公開（公告）日: 2022-11-11
• 發明（設計）人: 韋宇拓;汪桂萍;孫暢;潘世優;杜麗琴
• 申請（專利權）人: 廣西大學
• 主分類號: C12N15/56
• 分類號: C12N15/56;C12N9/28;C12P19/14;C12P19/04
• 代理公司: 南寧市吉昌知識產權代理事務所(普通合伙) 45125
• 代理人: 滕藝瓊

本發明公開了一種蠟樣芽胞桿菌高產麥芽五糖α?淀粉酶的突變體，所述蠟樣芽胞桿菌高產麥芽五糖α?淀粉酶突變體的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本發明蠟樣芽胞桿菌α?淀粉酶的突變體水解淀粉獲得麥芽五糖含量達到60％的糖漿，再經過大孔樹脂AB?8進行純化后，麥芽五糖純度達到93％。

技術領域

本發明涉及酶工程和基因工程領域，具體涉及一種蠟樣芽胞桿菌高產麥芽五糖α-淀粉酶的突變體及其應用。

背景技術

麥芽五糖是由五個葡萄糖聚合而成的一種麥芽低聚糖，不僅可以作為臨床檢查用試劑，用于診斷急性肝炎等各種疾病，在保健和醫療上有特殊用途，還可以作為新的功能食品原料，可見作為麥芽低聚糖的一種，麥芽五糖集營養與功能為一體有著廣闊的發展前景。麥芽五糖一般是通過淀粉的水解產物中分離純化得到，即利用淀粉酶不完全水解淀粉形成麥芽寡糖糖漿，然后再通過層析方法分離純化到麥芽五糖，因此麥芽寡糖糖漿中目的產物麥芽五糖含量越高，越容易分離純化，生產成本越低。麥芽五糖實際生產中要控制淀粉水解獲得麥芽五糖含量高的麥芽寡糖糖漿存在工藝復雜，目的產物含量低等諸多問題，導致生產成本很高，所以找到能水解淀粉獲得高產麥芽五糖的淀粉酶是降低麥芽五糖生產成本的有效方法。

目前在國際上僅有少數國家開始生產麥芽五糖，國內對麥芽五糖的研究較少，一般是尋找水解淀粉生成麥芽寡糖含量多的淀粉酶來水解淀粉，然后從麥芽寡糖糖漿中純化麥芽五糖。但這些淀粉酶的反應產物除了較多的麥芽五糖外，還生成較多的葡萄糖、麥芽糖等副產品。為了解決這一難題，可以采用大通量篩選得到只水解產生麥芽五糖的淀粉酶的菌株或者對已知麥芽五糖淀粉酶進行改造從而提高麥芽五糖的純度和產量，包括采取分子生物學技術、酶工程技術、基因工程技術等方法對菌種進行改良。

發明內容

本發明針對上述技術問題，提供一種蠟樣芽胞桿菌高產麥芽五糖α-淀粉酶的突變體及其應用，在對蠟樣芽胞桿菌(Bacillus cereus)的α-淀粉酶研究中，發現其水解淀粉產物的麥芽五糖含量很高，并進一步通過酶分子改造使其能水解淀粉獲得麥芽五糖含量更高的糖漿，并優化了水解淀粉制備麥芽五糖的反應條件和純化工藝。

為實現上述目的，本發明提供的技術方案如下：

一種蠟樣芽胞桿菌高產麥芽五糖α-淀粉酶突變體，通過對來自蠟樣芽胞桿菌的高產麥芽五糖α-淀粉酶進行蛋白質工程的改造和篩選得到；所述蠟樣芽胞桿菌高產麥芽五糖α-淀粉酶的突變體的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述蠟樣芽胞桿菌高產麥芽五糖α-淀粉酶的突變體的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其中161位點的酪氨酸(Y)突變為纈氨酸(V)。

所述蠟樣芽胞桿菌高產麥芽五糖α-淀粉酶的突變體在水解淀粉生產麥芽五糖中的應用。

本發明是經過對許多位點的預測分析，并對獲得的多個候選位點進行突變研究和篩選比較才獲得的，本發明所述的實施方法僅僅是對獲得本發明突變酶實驗過程的描述，而不包括對其它候選位點的突變實驗過程的陳述。PCR定點飽和突變技術、基因表達技術和重組蛋白質的純化技術，本實施方案中未作詳細說明的分子生物學實驗方法均為分子生物學專業人員熟悉的常規實驗方法。

與現有技術相比，本發明具有如下有益效果：

本發明將蠟樣芽胞桿菌的α-淀粉酶突變體水解淀粉獲得麥芽五糖含量達到60％的糖漿，再經過大孔樹脂AB-8進行純化后，麥芽五糖純度達到93％。

附圖說明

圖1是溫度對酶水解淀粉活力的影響的曲線圖。

圖2是pH對酶水解淀粉活力的影響的曲線圖。

圖3是酶水解淀粉產物的高效液相色譜檢測分析圖。

圖4是純化后麥芽五糖的高效液相色譜檢測分析圖。

具體實施方式