[發(fā)明專利]基于CRISPR熒光法檢測大西洋鮭核酸的檢測方法及其檢測試劑盒

有效

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• 申請日: 2021-04-23
• 公開（公告）號: CN112852980B
• 公開（公告）日: 2021-11-26
• 發(fā)明（設計）人: 蔡一村;王鑫杰;潘良文;熊煒;王強;林穎錚
• 申請（專利權(quán)）人: 上海海關(guān)動植物與食品檢驗檢疫技術(shù)中心;上海科技大學
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/6844;C12N15/113
• 代理公司: 上海華工專利事務所(普通合伙) 31104
• 代理人: 趙孟琴;繆利明

本發(fā)明公開了一種基于CRISPR熒光法檢測大西洋鮭核酸的檢測試劑盒，包括適用于大西洋鮭快速核酸檢測的CRISPR的熒光檢測體系，所述CRISPR的熒光檢測體系包括：針對大西洋鮭線粒體靶序列的特異性crRNA、高效等溫擴增引物組合、CRISPR蛋白和ssDNA報告系統(tǒng)。本發(fā)明還公開一種基于CRISPR熒光法檢測大西洋鮭核酸的快速檢測方法，其是采用所述的基于CRISPR熒光法檢測大西洋鮭核酸的檢測試劑盒進行檢測。本發(fā)明的檢測試劑盒，既可利用酶標儀熒光檢測，也可以利用熒光肉眼檢測，具有良好的靈敏性和特異性。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物學技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，是關(guān)于一種基于CRISPR熒光法檢測大西洋鮭核酸的檢測方法及其檢測試劑盒。

背景技術(shù)

我國三文魚養(yǎng)殖能力不足，而真正高品質(zhì)的三文魚數(shù)量有限、價錢高、需求大，大量依靠進口，因此才會出現(xiàn)眾多商家和企業(yè)盯準三文魚這塊“肥肉”，和消費者玩起“偷換概念”的游戲。真正意義上的三文魚（特指大西洋鮭，Salmon salar）是一種冷水魚類，適宜生活在16至18攝氏度的水中，對水質(zhì)的要求非常高，在養(yǎng)殖中稍有不慎就會導致死亡。由于成本原因，售價一直居高不下。大西洋鮭主要的物理替代物種為虹鱒（Oncorhynchusmykiss），鮭科大馬哈魚屬（太平洋鮭屬）的一種魚類，英文名為rainbown trout。原產(chǎn)于北美洲北部和太平洋西岸，多數(shù)種群終身生活于低溫淡水環(huán)境中。繁殖期的雄魚上下頜變得彎曲，體側(cè)從腮部至尾部的彩虹般桃紅色縱帶也越發(fā)艷麗，虹鱒的名字也由此而來。切片生食的虹鱒和大西洋鮭魚物理性質(zhì)十分相似，普通老百姓但從外表很難區(qū)分。

目前，中國三文魚消費已進入快車道，到2018年我國三文魚市場需求規(guī)模將接近90億元，市場需求空前巨大，而我國目前現(xiàn)行標準均沒有針對大西洋鮭魚和虹鱒的物種鑒定方法或試劑盒進行區(qū)分，這就導致了嚴重的技術(shù)斷層。這一技術(shù)斷層使得相關(guān)食品安全，市場監(jiān)督監(jiān)管部門在面對大西洋鮭或虹鱒相關(guān)產(chǎn)品物種鑒定需求時拿不出現(xiàn)行有效的檢測技術(shù)依據(jù)。在面對突然的輿情、巨大的市場需求、價格差異，相關(guān)檢測技術(shù)缺失必將產(chǎn)生嚴重的食品安全監(jiān)管漏洞。如何利用技術(shù)手段對相關(guān)動物源性制品進行生物監(jiān)測將是業(yè)界面臨的一個重大挑戰(zhàn)。因此迫切需要建立精確、快速、高靈敏的大西洋鮭魚特異性檢測技術(shù)體系對大西洋鮭魚及其產(chǎn)品進行物種鑒定。

目前，對于魚類物種的鑒定技術(shù)主要依賴于傳統(tǒng)形態(tài)學鑒定技術(shù)、蛋白質(zhì)電泳法、實時熒光定量檢測技術(shù)和基于擴增子測序和DNA條形碼檢測技術(shù)。形態(tài)學鑒定技術(shù)依賴于專業(yè)人士的長期研究積累，可以快速對物種進行區(qū)分，但是其鑒定嚴重依賴于完整的特征性形態(tài)，而對于相關(guān)制品，特別是加工過的樣本，例如罐頭類、肉類、血液等不具備形態(tài)學特征的樣本則無法完成鑒定。蛋白質(zhì)相關(guān)分析方法對于經(jīng)過加熱的導致蛋白變性的樣本也無法完成檢測鑒定。而基于DNA的分子生物學方法則體現(xiàn)出了明顯的檢測優(yōu)勢。但熒光定量PCR技術(shù)和基于擴增子測序和DNA條形碼檢測技術(shù)均嚴重依賴高級別分子生物學實驗室和較為大型的儀器設備，且檢測成本較高，檢測周期也比較長，無法滿足現(xiàn)場快速檢測的實際場景需求。

CRISPR-Cas（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPRs）是細菌中一種適應性免疫系統(tǒng)，Cas蛋白通過RNA引導的核酸酶靶向降解外來核酸。其中，CRISPR-CRISPR屬于Cas酶第二家族，用來引導RNA指導雙鏈DNA裂解單個RuvC催化結(jié)構(gòu)域。CRISPR酶識別富含胸腺嘧啶（Thymine, T）核苷酸的間隔區(qū)相鄰基序（PAM），催化它們自身的指導CRISPR RNA（crRNA）成熟，并特異性識別和切割互補配對的雙鏈DNA(dsDNA)。當CRISPR-CRISPR蛋白以序列特異性方式識別切割靶雙鏈DNA時，能誘導強大的非特異性單鏈DNA（ssDNA）反式切割活性。

發(fā)明內(nèi)容