[發(fā)明專(zhuān)利]枇杷炭疽病菌巢式PCR特異性引物及其檢測(cè)方法和應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110442148.0
• 申請(qǐng)日: 2021-04-23
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN113025744A
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-06-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 吳頔;袁婷;梁國(guó)魯;郭啟高;張紅楠
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 西南大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/6895
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/6895;C12Q1/6848;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 重慶智慧之源知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 50234
• 代理人: 高彬

1.一種枇杷炭疽菌巢式PCR特異性引物，其特征在于：所述枇杷炭疽菌為枇杷膠孢炭疽菌(C.gloeosporioides)或枇杷尖孢炭疽菌(C.acutatum)；

所述枇杷膠孢炭疽菌(C.gloeosporioides)的ITS區(qū)內(nèi)側(cè)特異性引物的上游引物Cg1F:5’-GAAGGAAGGGTCTCCGCGAC-3’；

所述枇杷膠孢炭疽菌(C.gloeosporioides)的ITS區(qū)內(nèi)側(cè)特異性引物的下游引物Cg1R:5’-TCCTAGTGCGAGACGTAA-3’；

所述枇杷尖孢炭疽菌(C.acutatum)的ITS區(qū)內(nèi)側(cè)特異性引物的上游引物Ca1F:5’-ACCCTTTGTGACATACCTAACC-3’；

所述枇杷尖孢炭疽菌(C.acutatum)的ITS區(qū)內(nèi)側(cè)特異性引物的下游引物Ca1R:5’-GAGCCGAGTTCAACCTGTAA-3’。

2.如權(quán)利要求1所述枇杷炭疽菌巢式PCR特異性引物，其特征在于：巢式PCR的檢測(cè)過(guò)程中，所述枇杷炭疽菌的ITS區(qū)外側(cè)通用引物的上游引物：ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'；所述枇杷炭疽菌的ITS區(qū)外側(cè)通用引物的下游引物：ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。

3.一種枇杷炭疽菌巢式PCR高效檢測(cè)方法，其特征在于：先提取待測(cè)樣品基因組DNA，以獲得的基因組DNA為模板，利用權(quán)利要求2所述通用引物作為第一輪反應(yīng)引物進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增，然后以第一輪PCR反應(yīng)產(chǎn)物作為第二輪PCR擴(kuò)增的模板，權(quán)利要求1所述特異性引物對(duì)Cg1F/R或Ca1F/R作為第二輪PCR擴(kuò)增引物進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，最后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，通過(guò)目標(biāo)片段判定供試樣品是否攜帶膠孢炭疽菌或尖孢炭疽菌。

4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于：第一輪PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性5min；94℃變性40s，56℃退火40s，72℃延伸30s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存。

5.如權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于：第二輪PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，65℃退火30s，72℃延伸30s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸7min，4℃保存。

6.如權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于：若利用引物對(duì)Cg1F/R擴(kuò)增出一條392bp的特異性條帶，則確定所測(cè)樣本為膠孢炭疽菌或被膠孢炭疽菌侵染的枇杷組織；若利用引物對(duì)Ca1F/R擴(kuò)增出一條490bp的特異性條帶，則確定所測(cè)樣本為尖孢炭疽菌或被尖孢炭疽菌侵染的枇杷組織。