[發(fā)明專利]一種含微血管管腔的雙層皮膚及其制備方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110442075.5
• 申請(qǐng)日: 2015-09-25
• 公開（公告）號(hào): CN113355274A
• 公開（公告）日: 2021-09-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 盧永波
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣東博溪生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/071
• 分類號(hào): C12N5/071
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明制備的一種含微血管管腔雙層皮膚，具有兩層皮膚結(jié)構(gòu)，自上而下分別為表皮層，含有微血管管腔的真皮層；表皮層由表皮細(xì)胞生發(fā)復(fù)層組成，含有微血管管腔的真皮層由成纖維細(xì)胞、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞、臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)建而成，其通過將成纖維細(xì)胞、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞以及臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞以一定比例混合，使用多次接種法，利用細(xì)胞自身胞外基質(zhì)分泌能力和旁分泌系統(tǒng)，一方面形成皮膚真皮的組織學(xué)結(jié)構(gòu)，另一方面促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，遷移，管腔形成及穩(wěn)定。這種模擬正常人體皮膚組配，通過細(xì)胞間相互作用和相互影響達(dá)到真皮層構(gòu)成及真皮內(nèi)微管腔形成的組織構(gòu)建方法，避免了人為添加外源支架及血管前新生因子所帶來結(jié)構(gòu)和功能的不穩(wěn)定以及操作的繁瑣。

本分案申請(qǐng)是基于申請(qǐng)?zhí)?01510619910.2，申請(qǐng)日為2015年9月25日，發(fā)明名稱為“一種含微血管管腔的雙層皮膚及其制備方法”的中國專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)工程中組織工程技術(shù)領(lǐng)域，主要涉及一種含微血管管腔的雙層皮膚及其制備方法。

背景技術(shù)

正常皮膚細(xì)胞對(duì)氧氣和營養(yǎng)的需求、代謝廢物的清除是靠細(xì)胞附近的血液擴(kuò)散和運(yùn)輸作用實(shí)現(xiàn)，而目前基于成纖維細(xì)胞復(fù)合支架材料和表皮細(xì)胞構(gòu)建的雙層皮膚因缺乏血管結(jié)構(gòu)，無法滿足長期存活及功能性的要求，導(dǎo)致成纖維細(xì)胞的功能失調(diào)，角化細(xì)胞的遷移能力和增殖能力降低，最終造成皮膚組織的功能受限；將構(gòu)建好的雙層皮膚移植到創(chuàng)面上，由于雙層皮膚中活細(xì)胞營養(yǎng)成分的獲取和廢物的排泄主要依靠創(chuàng)面基底的滲液完成，因此細(xì)胞的物質(zhì)交換速度慢，嚴(yán)重影響雙層皮膚中活細(xì)胞的存活及其功能的實(shí)現(xiàn)。含血管皮膚除了提高皮膚存活時(shí)間及功能之外，這種具有分化結(jié)構(gòu)的雙層皮膚還可以用于血管機(jī)制的基礎(chǔ)科學(xué)研究，以及篩選對(duì)血管生成有抑制或促進(jìn)作用的藥物。

因此，如何構(gòu)建出含有血管的雙層皮膚及加速人工真皮替代物血管化引起廣大研究者的關(guān)注。現(xiàn)有的血管化工程皮膚多數(shù)都是以細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）替代物為支架進(jìn)行構(gòu)建，例如2004年5月，金巖等人申請(qǐng)了有關(guān)專利（中國專利申請(qǐng)?zhí)?3134540.9），該發(fā)明利用Ⅰ型膠原作為支架結(jié)構(gòu)構(gòu)建了含有血管結(jié)構(gòu)的組織工程皮膚。細(xì)胞外基質(zhì)替代物盡管能構(gòu)成細(xì)胞生長的外部微環(huán)境，但同時(shí)也帶來很多外源性物質(zhì)，例如牛膠原，同種異體真皮層、人造聚合物等，這些都存在一定的缺陷，即不同外源性物質(zhì)的免疫原性，降解率，降解產(chǎn)物的毒性，宿主免疫應(yīng)答，支架降解引起的組織纖維化，以及同周圍組織機(jī)械性的不匹配，都可能成為影響構(gòu)建皮膚結(jié)構(gòu)的長期生物活性以及主要生物功能的關(guān)鍵因素。并且細(xì)胞外基質(zhì)替代物均并非是由細(xì)胞自身分泌，外源性的添加不利于細(xì)胞間信號(hào)的傳導(dǎo)，進(jìn)而影響構(gòu)建皮膚的結(jié)構(gòu)及功能發(fā)揮。

另外，目前構(gòu)建含微血管的雙層皮膚模型主要在以成纖維細(xì)胞為主的真皮層加入內(nèi)皮細(xì)胞，同時(shí)添加血管前新生因子以促進(jìn)皮膚內(nèi)的血管生成。現(xiàn)常用的添加因子有：血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，堿性成纖維生長因子(bFGF)以及血小板源性生長因子(PDGF)等，此方法經(jīng)常需要重復(fù)實(shí)施或嚴(yán)格控制釋放系統(tǒng)，例如所添加因子的濃度，不同添加因子間的配比以及各個(gè)因子作用時(shí)間等，這些均不可避免的造成整個(gè)構(gòu)建過程的復(fù)雜性及不穩(wěn)定性，在一定程度上限制了其應(yīng)用。發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明的目的是提出一種含微血管管腔的雙層皮膚及其制備方法，通過將成纖維細(xì)胞，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞以及臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞以一定比例混合，使用多次接種法，利用細(xì)胞自身胞外基質(zhì)分泌能力和旁分泌系統(tǒng)，一方面形成皮膚真皮的組織學(xué)結(jié)構(gòu)，另一方面促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，遷移，管腔形成及穩(wěn)定。這種模擬正常人體皮膚組配，通過細(xì)胞間相互作用和相互影響達(dá)到真皮層構(gòu)成及真皮內(nèi)微管腔形成的組織構(gòu)建方法，避免了人為添加外源支架及血管前新生因子所帶來結(jié)構(gòu)和功能的不穩(wěn)定以及操作的繁瑣。

本發(fā)明制備的含微血管管腔雙層皮膚，具有兩層皮膚結(jié)構(gòu)，自上而下分別為表皮層，含有微血管管腔的真皮層；所述表皮層由表皮細(xì)胞生發(fā)復(fù)層組成；所述含有微血管管腔的真皮層由成纖維細(xì)胞、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞和臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)建而成。

本發(fā)明所提出的含微血管管腔雙層皮膚的制備方法，包括以下步驟：

步驟一、成纖維細(xì)胞和表皮細(xì)胞的提取：