[發明專利]一種孔徑可控的復合型聚丙烯酰胺凝膠及其制備方法

在審

• 申請號: 202110441094.6
• 申請日: 2021-04-23
• 公開（公告）號: CN113358875A
• 公開（公告）日: 2021-09-07
• 發明（設計）人: 丁顯廷;謝海洋;張婷;郭文珂
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/531;G01N21/33;G01N21/35
• 代理公司: 上海旭誠知識產權代理有限公司 31220
• 代理人: 鄭立

本發明提供了一種孔徑可控的復合型聚丙烯酰胺凝膠及其制備方法。本發明第一方面提供了一種孔徑可控的復合型聚丙烯酰胺凝膠的制備方法，包括如下步驟：將氧化石墨烯、丙烯酸、二氯亞砜、對苯二酚和三乙胺混合，并在保護氣體氛圍下合成丙烯酸功能化石墨烯；將丙烯酸功能化石墨烯溶于二甲基甲酰胺中，得到功能化石墨烯的二甲基甲酰胺溶液；將功能化石墨烯的二甲基甲酰胺溶液、丙烯酰胺、N?異丙基丙烯酰胺水溶液、Tris?HCl、SDS、TritonX?100、光敏化合物MAP?mPyTC以及APS和TEMED混合得到復合型聚丙烯酰胺凝膠。根據本發明提供的制備方法制備得到的復合型聚丙烯酰胺凝膠，可根據溫度調控其尺寸，并且凝膠尺寸調控可逆，所需變化時間短。

技術領域

本發明涉及分子生物學技術領域，尤其涉及一種孔徑可控的復合型聚丙烯酰胺凝膠及其制備方法。

背景技術

蛋白質印跡法(Western Blot)是細胞與分子生物學和免疫遺傳學中常用的一種蛋白測定方法。具體流程是通過使用凝膠電泳分離樣品中的蛋白質，隨后將蛋白質轉移到膜(例如：硝酸纖維素或PVDF膜)，接著用對靶蛋白質具有特異性的抗體來檢測樣品中的蛋白質。由于蛋白是經過電泳分離后再進行抗體結合反應，故較少受到抗體交叉反應性的影響。因此，即使在復雜的樣品如細胞裂解物中，也能夠清楚地區分靶上和靶外信號。然而，傳統的蛋白印跡方法中所測定的結果是基于大量細胞樣品的蛋白平均表達水平，其結果掩蓋了單個細胞蛋白的表達量的特殊性和多樣性。UC伯克利大學的Amy Herr教授提出一種單細胞的蛋白質印跡術(Single-cell western blot)，采用基于N-(3-((4-benzoylphenyl)formamido)propyl)methacrylamide(BPMAC)光敏型凝膠原位固定電泳分離后的蛋白進行免疫印跡，在一塊微芯片上實現數千個單細胞蛋白質表達水平的測定和細胞異質性的研究。單細胞蛋白質免疫印跡實驗的基本流程包括：(1)單細胞捕獲和裂解：細胞在分選后，經重力作用沉降進入單細胞捕獲單元；(2)凝膠電泳：加入預熱至55℃的類RIPA的裂解電泳緩沖液裂解15秒。細胞在裂解后，在芯片兩端施加電場，蛋白在電場的作用下進入芯片表面的凝膠涂層中，并開始電泳分離；(3)蛋白固定：凝膠電泳結束后，通過對凝膠表面進行一定波長和強度的紫外光激發照射，使凝膠涂層蛋白條帶中蛋白分子和凝膠單體分子原位聚合；(4)免疫印跡蛋白分析：將固定好的蛋白分子用特異性的一抗結合，洗脫，再用帶有熒光或發光基團標記的二抗結合，洗脫。最后在激光共聚焦熒光顯微鏡下，測定目標蛋白分子的熒光信號強度。

傳統的聚丙烯酰胺凝膠在電泳時充當分子篩基質，使得蛋白質分離；抗原抗體反應時，凝膠固定住蛋白質充當免疫印跡的支架。然而傳統的凝膠支持介質性能單一，凝膠孔徑固定，往往只能分離分子量在30-250kDa的蛋白質，極大地限制了單細胞蛋白質免疫印跡技術的應用。當凝膠孔徑過大時，小分子量蛋白質的分離分辨率較低，蛋白質固定效率減低，極大的影響了檢測結果的準確性；大分子量蛋白在抗體孵育過程，抗體由于分子量過大難以進入凝膠基質結構與凝膠內固定住的蛋白質分子反應結合，極大的影響了檢測結果的靈敏度與線性范圍。

因此，設計研究合成方法簡單、對小分子量蛋白質分離分辨率高，同時在抗體孵育環節可使凝膠孔徑變大，使得抗體易于進入凝膠介質內的聚丙烯酰胺凝膠對單細胞蛋白質免疫印跡技術的生物學應用具有重要的理論和現實意義。

發明內容

有鑒于現有技術的上述缺陷，本發明所要解決的技術問題是提供一種對小分子量蛋白質分離分辨率高，孔徑可控的復合型聚丙烯酰胺凝膠。

為實現上述目的，本發明提供了一種孔徑可控的復合型聚丙烯酰胺凝膠的制備方法，包括如下步驟：

步驟1、將氧化石墨烯、丙烯酸、二氯亞砜、對苯二酚和三乙胺混合，并在保護氣體氛圍下合成得到丙烯酸功能化石墨烯；

步驟2、將所述丙烯酸功能化石墨烯溶于二甲基甲酰胺中，得到功能化石墨烯的二甲基甲酰胺溶液；