[發明專利]一種高純度的鴨肌內前體脂肪細胞分離方法在審
| 申請號： | 202110439247.3 | 申請日： | 2021-04-23 |
| 公開（公告）號： | CN112920993A | 公開（公告）日： | 2021-06-08 |
| 發明（設計）人： | 王志秀;梁文雙;田慧月;嚴丹;董丙強;畢瑜林;常國斌;陳國宏 | 申請（專利權）人： | 揚州大學 |
| 主分類號： | C12N5/077 | 分類號： | C12N5/077 |
| 代理公司： | 揚州蘇中專利事務所(普通合伙) 32222 | 代理人： | 沈志海 |
| 地址： | 225009 *** | 國省代碼： | 江蘇;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 純度 鴨肌內前體 脂肪 細胞 分離 方法 | ||
1.一種高純度的鴨肌內前體脂肪細胞分離方法，其特征在于，所述細胞分離方法具體步驟如下：
(1)用新潔爾滅清潔8天的櫻桃谷鴨身體3min；
(2)肉鴨頸動脈放血死亡之后，浸泡75%酒精5min；
(3)采集鴨胸肌組織樣，放入50ml的緩沖液于離心管里進行浸泡；
(4)用緩沖液清洗組織樣2遍，用75%酒精浸泡1min；
(5)移到超凈工作臺中，再用緩沖液清洗組織樣2遍，去除筋膜；
(6)把去除筋膜的胸肌組織樣移入西林瓶里，用剪刀剪碎胸肌組織樣；
(7)用混合液對胸肌組織樣進行裂解1h（搖床，自動搖1h），裂解至糊狀；
(8)用完全培養基終止消化，制成細胞懸液；
(9)依此使用50目網篩、200目網篩和400目網篩依次過濾細胞懸液，收集到離心管里離心，1000rpm/min，離心10min，棄上清，此時得到的沉淀即是細胞；
(10)先用緩沖液對步驟（9）中得到的細胞沉淀進行清洗，棄上清，對清洗過的細胞，加入紅細胞裂解液，吹打混勻，靜置15min，1000rpm/min，離心5min，棄上清；
(11)加入完全培養基，吹打混勻，1000rpm/min，離心5min，棄上清，得到肌內前體脂肪；
(12)用完全培養基吹打肌內前體脂肪細胞進行混勻，移到25cm2培養瓶里培養；
(13)利用細胞差速貼壁方法，于培養箱里培養肌內前體脂肪細胞1.5～2h后，更換新鮮的完全培養基，后續2～3天更換一次完全培養基。
2.一種高純度的鴨肌內前體脂肪細胞分離方法，其特征在于：步驟(3)中所述緩沖液為2%雙抗的PBS，具體為1ml雙抗+49mlPBS。
3.一種高純度的鴨肌內前體脂肪細胞分離方法，其特征在于：步驟(6)中所述混合液為膠原酶Ⅰ+膠原酶Ⅱ按照1：1的比例混合而成，膠原酶與剪碎的胸肌組織樣的體積比為4：1。
4.一種高純度的鴨肌內前體脂肪細胞分離方法，其特征在于：步驟(7)中所述搖床轉速為100rpm，溫度為37度。
5.一種高純度的鴨肌內前體脂肪細胞分離方法，其特征在于：步驟(8)中所述完全培養基為5ml血清+45mlDMEM構成，其血清與DMEM的比例為1:9。
6.一種高純度的鴨肌內前體脂肪細胞分離方法，其特征在于：步驟(10)中所述紅細胞裂解液為索萊寶紅細胞裂解液R1010。
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