[發明專利]一種魚類卵子的體外保存液及其應用

有效

• 申請號: 202110437774.0
• 申請日: 2021-04-22
• 公開（公告）號: CN113115767B
• 公開（公告）日: 2022-11-08
• 發明（設計）人: 肖亞梅;彭亮躍;何國敏;符文;劉錦輝;劉文彬
• 申請（專利權）人: 湖南師范大學
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02
• 代理公司: 長沙朕揚知識產權代理事務所(普通合伙) 43213
• 代理人: 郭蓓霏;楊斌

本發明公開了一種魚類卵子的體外保存液，按體積分數計其包含以下各組分：基礎培養液53.63％?82.87％、魚血清1.37％?2.13％和魚卵巢液15.0％?45.0％。本發明還公開了魚類卵子的體外保存液的應用，將離體的成熟魚類卵子浸泡于所述魚類卵子的體外保存液中，浸泡的條件為：700?1000μL/100?200粒，24?26℃下浸泡30min?60min。大大減少了卵巢液的使用，能夠有效維持卵膠膜結構和卵子活力，保證了卵子的受精能力，為魚類卵子體外顯微操作和遺傳育種研究工作提供了有利條件。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及一種魚類卵子的體外保存液及其應用。

背景技術

魚類主要為體外受精、體外發育的繁育方式。大多數真骨魚類的卵巢為封閉型卵巢，卵巢腹膜所形成的卵巢膜包圍，成熟的卵子不落在腹腔而落于卵巢腔中，經輸卵管輸出體外。成熟排出的魚類卵外面包有透明膠狀保護膜，稱為卵膠膜。卵膠膜對于卵和胚胎具重要保護作用：一方面能防御損傷、避免外環境對受精卵的侵害，使胚胎就能在相對穩定的環境中完成各階段的發育，提高胚胎的成活率；另一方面卵膠膜內的膠質有調節鈣離子濃度的作用，保護卵維持正常滲透壓，使卵達到最佳受精狀態。卵膠膜含有大量的糖蛋白，卵子產出遇水后，卵膠膜吸水膨脹，失去受精能力。卵子在卵巢液中較為穩定，但魚類卵巢液少、獲取量有限。在科學研究及生產實踐中，對于精卵產出不同步，尤其是開展卵子體外操作時，維持卵膠膜結構和卵子活力、提高受精發育率是亟待解決的技術瓶頸問題。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是，克服以上背景技術中提到的不足和缺陷，提供一種適用于維持魚類離體卵子卵膠膜結構和卵子活力的魚類卵子的體外保存液及其應用。

為解決上述技術問題，本發明提出的技術方案為：

一種魚類卵子的體外保存液，按體積分數計其包含以下各組分：基礎培養液53.63％-82.87％、魚血清1.37％-2.13％和魚卵巢液15.0％-45.0％。

上述的魚類卵子的體外保存液，優選的，所述體外保存液按體積分數計其包含以下各組分：基礎培養液68.25％、魚血清1.75％和魚卵巢液30.0％。

優選的，所述基礎培養液包括以下各組分及其濃度：谷氨酸580-590mg/L、D-葡萄糖0.8-1.5g/L、CaCl₂110-130mg/L、KCl 170-190mg/L、NaCl 6.0-7.0g/L、Na₂HPO₄135-145mg/L、HEPES 0.9-1.0g/L、NaHCO₃2.3-2.5g/L、MgCl·6H₂O 165-175mg/L和MgSO₄·7H₂O65-75mg/L。

本發明是結合魚類卵子發育特點和卵巢液組成成分分析，制備了一種適用于維持魚類離體卵子卵膠膜結構和卵子活力的卵巢液稀釋劑。稀釋劑基礎液中Glu(谷氨酸)和D-葡萄糖作為基本營養成分，并和鈣鹽、鉀鹽、鈉鹽、鎂鹽等無機鹽成分維持與卵子內部適宜的滲透勢，維持卵膠膜結構魚血清含有豐富的適合魚類細胞的營養成分，能夠為體外暫存的魚類細胞提供起穩定和解毒作用的因子，對離體卵起到保護作用。

優選的，所述魚類卵子的體外保存液的pH值為8.0-8.5，采用的pH調節劑為NaHCO₃溶液。

優選的，所述魚血清由以下方法得到：將魚的血液平鋪于培養皿中并轉入0-4℃冰浴環境下靜置3-4h；然后吸取析出的血清，0-4℃、3500-4000rpm離心8-15min，在無菌超凈工作臺中用過濾網過濾后收集血清，并于-20℃分裝保存。

優選的，所述魚卵巢液由以下方法得到：將魚卵在常溫下6000-8000rpm離心10-15min，收集上清液，-80℃分裝保存。