[發明專利]一種以幼葉為外植體快速構建花生再生體系的方法

在審

• 申請號: 202110434280.7
• 申請日: 2021-04-22
• 公開（公告）號: CN113040052A
• 公開（公告）日: 2021-06-29
• 發明（設計）人: 金華;金純伊;鄒吉祥;孫婧靚
• 申請（專利權）人: 大連民族大學
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 大連智高專利事務所(特殊普通合伙) 21235
• 代理人: 畢進

本發明屬于植物組織培養快速繁育技術領域，具體涉及一種以幼葉為外植體快速構建花生再生體系的方法。包括：(1)消毒浸種，(2)獲取花生無菌幼葉外植體，(3)誘導愈傷組織再分化形成不定芽，(4)不定芽伸長，(5)生根培養。本發明操作簡單高效，通過使花生幼葉再分化的方法，利用最少的外植體和激素配比，在短時間大量獲得優良花生無菌苗，為花生遺傳轉化及分子育種提供了基礎。

技術領域

本發明屬于植物組織培養快速繁育技術領域，具體涉及一種以幼葉為外植體快速構建花生再生體系的方法。

背景技術

花生(Arachis hypogaeaL.)具有豐富的營養價值，是我國食用植物油和食物蛋白的主要來源。其在我國農業經濟中占有重要地位，至今仍是中國出口的第一大作物。但隨著對花生的產量及品種需求的不斷擴大，對花生種質創新、品種培育和改良、遺傳轉化以及抗逆篩選的工作愈發嚴苛，而植物組織培養技術恰恰是滿足這些條件的基礎。在花生的組織培養過程中，未成熟胚、成熟胚、胚軸、子葉、葉片、莖尖及花粉等都可以作為外植體進行離體培養誘導獲得再生植株。但其再生體系建立尚不成熟，建立難度大，存在不同基因型再生差異大、畸形苗多、生長慢、生根難等難題。

發明內容

為了克服現有技術存在的不足，本發明利用花生品種“四粒紅”，提供一種以幼葉為外植體快速構建花生再生體系的方法，操作簡單高效，通過使花生幼葉再分化的方法，利用最少的外植體和激素配比，在短時間大量獲得優良花生無菌苗，為花生遺傳轉化及分子育種提供了基礎。

本發明的上述目的是通過以下技術方案實現的：

一種以幼葉為外植體快速構建花生再生體系的方法，具體包括以下幾個步驟：

(1)消毒浸種：選取成熟的花生種子消毒滅菌，將滅菌好的花生種子移至無菌水中浸種10h；

(2)獲取花生無菌幼葉外植體：將滅菌后的種子剝離種皮，接種到萌發培養基中，在25℃條件下，光照培養；

(3)誘導愈傷組織再分化形成不定芽：光照培養7d后在超凈工作臺上取已萌發的花生幼苗未展開的幼葉，用無菌的鑷子和刀片將幼葉切去主葉脈，葉片均分切三段，接種至愈傷組織誘導培養基中，培養25～35d；

(4)不定芽伸長：將誘導出的不定芽轉接至伸長培養基中，培養25～35d；

(5)生根培養：步驟(4)培養后的不定芽莖長至1.5～3cm時，轉移至生根培養基中，培養20～45d。

進一步地，花生品種為“四粒紅”；

進一步地，步驟(1)所述的種子消毒滅菌具體為：將成熟飽滿的“四粒紅”花生種子用75％乙醇溶液清洗30～45s，無菌水沖洗3～5次，再用0.1％氯化汞溶液消毒10～12min，然后用無菌水洗滌3～5次。

進一步地，步驟(2)所述的萌發培養基為MS培養基，其中蔗糖30～32g/L、瓊脂粉6.0～7.0g/L，pH值為5.80～5.84。

進一步地，步驟(3)所述的愈傷組織誘導培養基為MS培養基，其中蔗糖30～32g/L、瓊脂粉6.0～7.0g/L，pH值為5.80～5.84，并向其中添加了6-BA 6～8mg/L、NAA 1mg/L。

進一步地，步驟(4)所述的伸長培養基為步驟(3)所使用的培養基。

進一步地，步驟(5)所述的生根培養基為MS培養基，其中蔗糖30～32g/L、瓊脂粉6.0～7.0g/L，pH值為5.80～5.84，并向其中添加了NAA 1.5～2.5mg/L。

進一步地，步驟(3)、步驟(4)、步驟(5)中培養溫度為25℃，光照培養16h、暗培養8h，培養25～35d。

本發明與現有技術相比的有益效果是：