[發明專利]慈姑球莖發育過程中內參基因篩選及其應用

有效

• 申請號: 202110433945.2
• 申請日: 2021-04-21
• 公開（公告）號: CN113046367B
• 公開（公告）日: 2022-04-19
• 發明（設計）人: 高美萍;江文;陳清西;林志城;韋紹龍;蔣慧萍
• 申請（專利權）人: 福建農林大學;廣西壯族自治區農業科學院
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/11;C12Q1/6895;C12Q1/6809
• 代理公司: 廣西中知科創知識產權代理有限公司 45130
• 代理人: 牙斐穎

本發明涉及植物基因技術領域，特別涉及慈姑球莖發育過程中內參基因篩選及其應用，本發明本發明根據RNA?Seq測序數據分析，利用軟件評估并分析各個候選內參基因在球莖的整個發育階段中的表達穩定性，并利用目的基因驗證，最終篩選出比常用的管家基因更為穩定的內參基因C44587，最大程度地減小了由于內參基因的選擇造成樣品之間和樣品內部的差異，為后期利用q RT?PCR探索慈姑球莖發育相關關鍵基因奠定了堅實的基礎。

【技術領域】

本發明涉及植物基因技術領域，特別涉及慈姑球莖發育過程中內參基因篩選及其應用。

【背景技術】

慈姑是我國特色水生蔬菜之一，是澤瀉科(Alismaceae)慈姑屬(Sagittaria.L)水生植物，目前對于該水生植物的研究并不多，其屬于澤瀉科慈姑屬宿根性水生草本，營養器官為地下球莖，含有大量碳水化合物、蛋白質和多種礦質元素，具有很高營養價值。中醫認為慈姑性味甘平，生津潤肺，補中益氣，所以慈姑不但營養價值豐富，還能夠敗火消炎，輔助治療癆傷咳喘。慈姑藥食兼用，具有很大的應用市場和開發潛力。目前主要產品出口銷往東南亞、美國、加拿大等國家，是重要的出口創匯產品。

近年來，慈姑分子生物學的研究不斷深入和發展，基因表達分析也逐漸應用于揭示慈姑功能基因表達和調控的機理，準確評估基因表達量對研究其生物學功能具有重要意義。常見的內參基因有actin、EF-1α、TUA、TUB等。在不同的試驗條件下，表達分析的結果經常受樣品RNA提取質量、反轉錄效率等影響，常用的看家基因表達穩定性會有所變化。因此，為消除這些偏差，有必要篩選合適的內參基因。目前鮮見有關慈姑內參基因的研究報道，這嚴重制約了慈姑重要功能性狀基因等研究進程。因此，在慈姑中挖掘穩定表達的內參基因十分必要。

【發明內容】

鑒于上述內容，有必要挖掘慈姑的內參基因，可以很好的對慈姑的表達分析提供重要參考。

為達到上述目的，本發明所采用的技術方案是：

慈姑內參基因C44587，所述內參基因C44587的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。

本發明還包括檢測所述慈姑內參基因C44587的引物對，所述引物對其上游序列如序列表SEQ ID NO.2所示，下游序列如序列表SEQ ID NO.3所示。

本發明還包括所述的慈姑內參基因C44587在慈姑球莖發育不同時期進行熒光定量表達分析的應用。

進一步的，所述熒光定量表達分析優選的引物對其上游序列如序列表SEQ IDNO.2所示，下游序列如序列表SEQ ID NO.3所示。

進一步的，所述熒光定量表達分析的PCR反應體系為：2X SYBR Green Master Mix10μl、10μM上游引物0.4μl、10μM下游引物0.4μl、ddH₂O 7.2μl、cDNA 2μl；反應程序為95℃預變性5min；95℃變性10s，55℃退火1min，總共45個循環；采集熒光信號。

本發明的慈姑內參基因C44587，篩選方法為：1、選擇不同時期的慈姑球莖為材料，提取慈姑球莖RNA；2、合成相應的慈姑球莖cDNA；3、根據不同基因設計不同引物并在熒光定量PCR儀上進行反應，繪制溶解曲線，進行穩定性分析，獲得穩定性好、表達效果好的內參基因。

本發明具有如下有益效果：

本發明根據RNA-Seq測序數據分析，利用軟件評估并分析各個候選內參基因在球莖的整個發育階段中的表達穩定性，并利用目的基因驗證，最終篩選出比常用的管家基因更為穩定的內參基因C44587，最大程度地減小了由于內參基因的選擇造成樣品之間和樣品內部的差異，為后期利用q RT-PCR探索慈姑球莖發育相關關鍵基因奠定了堅實的基礎。

【附圖說明】