[發明專利]一種具有大視場的多色三維超分辨膨脹顯微鏡系統

有效

• 申請號: 202110431378.7
• 申請日: 2021-04-21
• 公開（公告）號: CN113325563B
• 公開（公告）日: 2022-06-10
• 發明（設計）人: 郝翔;袁地福;涂世杰;劉旭
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: G02B21/00
• 分類號: G02B21/00;G01N21/64
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 劉靜

本發明公開了一種具有大視場的多色三維超分辨膨脹顯微鏡系統，屬于顯微成像領域，該系統利用空間光調制器和變形鏡等自適應元件對光學像差進行校正，同時引入色散補償組件對激發光源進行色散校正。該系統可以避免由于光學像差對超分辨顯微鏡系統性能產生影響，在保證系統分辨率的同時，可以增大三維成像視場。同時，與已有方法相比，本發明所公開的系統可以很方便地實現多色成像。

技術領域

本發明涉及光學顯微成像以及細胞生物學領域，特別用于熒光顯微鏡實現大視場的多色三維超分辨膨脹顯微成像。

背景技術

自從2014年諾貝爾化學獎頒給了Eric Betzig、Stefan W.Hell和WilliamE.Moerner三人之后，超分辨顯微成像技術取得了長足的發展，并且逐步走向實用化。在理論上，現有的主流超分辨顯微成像方法，包括目標開關(STED(stimulated emissiondepletion microscopy)、RESOLFT)、單分子定位(PALM、STORM、FPALM、GSDIM)、飽和結構光照明(SSIM)、熒光振蕩(SOFI)等，均可以獲得無限小的分辨能力。在對生物樣品成像時，大多可以實現橫向30-80nm，軸向分辨100nm左右的分辨率水平。雖然依靠光學系統的改進可以在一定程度上改善時空分辨能力，但其總體提升效果往往受到樣品本身熒光性能的限制，即在現有技術條件下，信息原位生成質量的不足對顯微鏡分辨率的提高構成巨大障礙。

2015年，Edward Boyden實驗室發表了被稱為“膨脹顯微”的新方法(ExpansionMicroscopy，ExM)，為提高顯微成像技術分辨能力提供了新思路。該方法通過將生物樣本各向同性地物理放大，使得尺寸小于傳統顯微鏡分辨率的樣品可以在膨脹狀態后被解析。此外，膨脹處理后的樣本是幾乎透明的，極大地減少了背景噪聲，提高了獲取圖像的對比度。在隨后的幾年，ExM發展迅速，針對不同的熒光標記手段提出了不同的改進版本：包括使用傳統抗體標記或熒光蛋白的膨脹方法protein-retention ExM(proExM)、使用原位雜交標記RNA的膨脹方法expansion FISH(ExFISH)、通過重復進行樣本膨脹實現極高分辨率的膨脹方法iterative ExM(iExM)，以及出于病理學或診斷學的目的研究人類組織樣本的膨脹方法expansion pathology(ExPath)等。從本質而言，ExM是一種樣品處理方法而不依賴于具體成像技術，因此幾乎可以與所有的現有光學顯微成像技術相兼容。

2018年，Helge Ewers實驗室將ExM與STED超分辨顯微成像技術結合實現ExSTED，進一步提高了分辨率，實現了二維～10nm、三維50-70nm的分辨率，并且通過2D ExSTED看到了微管的管狀結構。但是，如果要觀察更深(5μm以上的深度)的結構，則會由于折射率不匹配而產生球差。為解決這個問題，Helge Ewers課題組使用的方法是將油鏡換成水鏡，在一定程度上減小球差的影響，但同時也使得三維分辨率50nm降至70nm。除此之外，實際中這種技術結合還存在著巨大挑戰，其主要瓶頸，包括：膨脹造成的實際視場范圍縮小、成像速度變慢問題和熒光標記密度降低、性能惡化(主要是熒光漂白和熒光信號降低)問題等。

發明內容

本發明的目的為提供一種具有大視場的多色三維超分辨膨脹顯微鏡系統，在保證膨脹STED顯微鏡具有大視場的同時，兼顧它的多色成像功能。

為了實現上述目的，本發明提供一種具有大視場的多色三維超分辨膨脹顯微鏡系統，該系統包括：照明單元和探測單元。

所述照明單元包括損耗光光路、激發光光路和混合光光路。

所述損耗光光路依次設有損耗光光源、第一光調制器、相對位相延遲組件、第一反射鏡、第一望遠組件、對抑制光束進行相位調制的相位調制組件、第二望遠組件、第二反射鏡、第一1/2波片、第三望遠組件；其中相對位相延遲組件將損耗光光束分束為兩個互相垂直的偏振分量并對這兩個分量產生位相延遲以破壞其相干性。