[發明專利]一種嘌呤/嘧啶核苷磷酸化酶串聯表達工程菌及應用

在審

• 申請號: 202110425256.7
• 申請日: 2021-04-20
• 公開（公告）號: CN113373100A
• 公開（公告）日: 2021-09-10
• 發明（設計）人: 王振宇;張震;劉玉雪;王海磊;劉國生
• 申請（專利權）人: 河南師范大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12P19/38;C12R1/19
• 代理公司: 新鄉市平原智匯知識產權代理事務所(普通合伙) 41139
• 代理人: 路寬

本發明公開了一種嘌呤/嘧啶核苷磷酸化酶串聯表達工程菌及應用，將嘌呤/嘧啶核苷磷酸化酶基因導入宿主大腸桿菌中進行串聯表達獲得嘌呤/嘧啶核苷磷酸化酶串聯表達工程菌，并將該嘌呤/嘧啶核苷磷酸化酶串聯表達工程菌應用于核苷類似物的中試及規模化的綠色轉化，采用本發明的嘌呤/嘧啶核苷磷酸化酶制備阿糖核苷類藥物，底物廣譜，底物轉化率高，產物易于純化，反應條件溫和，產物成分較為單一，副產物較少。

技術領域

本發明屬于生物醫藥工程技術領域，具體涉及一種嘌呤/嘧啶核苷磷酸化酶串聯表達工程菌及應用。

背景技術

嘌呤核苷磷酸化酶（Purine nucleoside phosphorylase，簡稱PNPase）廣泛存在于真核生物和原核生物中，是嘌呤補救合成途徑的關鍵酶之一，能夠可逆地催化嘌呤核苷（或脫氧核苷）發生磷酸化反應生成核糖（或脫氧核糖）-1-磷酸和對應的嘌呤堿基。細菌的PNPase作用底物廣泛，己被用于合成阿糖腺苷，利巴韋林，5-甲基尿苷等一系列核苷類物質。

尿苷磷酸化酶（UPase）屬于嘧啶磷酸化酶，能夠可逆性地催化尿苷形成尿嘧啶。已被用于合成2′-氟尿苷，脫氧氟尿苷等，脫氧氟尿苷是一種良好的抗代謝類抗腫瘤藥物，在腫瘤細胞內受腫瘤組織中嘧啶核苷磷酸化酶的作用而轉化為真正起作用的5-氟尿嘧啶。

嘌呤核苷磷酸化酶單獨作用時可合成腺苷、三氮唑核苷及其類似物；尿苷磷酸化酶單獨作用時可以合成尿苷及其類似物，其中5-氟尿苷是重要的抗腫瘤藥物。當嘌呤核苷與嘧啶核苷之間相互轉化時，需要PNPase和UPase共同參與反應，可合成腺苷、肌苷、尿苷、鳥苷及其類似物等核苷類化合物，實現多種核苷類似物的定向酶促轉化。例如以阿糖尿苷和腺嘌呤為底物合成阿糖腺苷，及以阿糖尿苷（ara-U）和2,6-二氨基嘌呤為底物合成阿糖2,6-二氨基嘌呤核苷（ara-DA）。阿糖腺苷是一種天然抗病毒化合物，具有廣譜的抗皰疹和嗜肝DNA病毒活性，同時還有抑制乙肝病毒復制的作用。

磷酸化酶在野生菌株中含量較少或活性較低，現有技術中完成嘧啶或嘌呤核苷轉化的一種方法是通過構建單一酶的過表達菌株，并結合工程菌自身本底表達的另一種磷酸化酶完成，但受本底表達的低活性酶限制而無法工程化應用；另一種方法是通過偶聯兩種工程菌株來完成，但涉及底物和中間代謝產物在菌株之間的傳遞，且需考察酶活性及菌種的比例協同，步驟繁瑣，回收率低，成本較高。因此，該技術利用基因工程手段構建兩種酶串聯表達的工程菌株，利用兩種酶的協同作用進行核苷類化合物的定向轉化合成，突破單一酶催化的底物局限性和可逆性。

發明內容

本發明解決的技術問題是提供了一種嘌呤/嘧啶核苷磷酸化酶串聯表達工程菌，并將該嘌呤/嘧啶核苷磷酸化酶串聯表達工程菌應用于核苷類似物的中試及規模化的綠色轉化，采用本發明的嘌呤/嘧啶核苷磷酸化酶制備阿糖核苷類藥物，底物廣譜，底物轉化率高，產物易于純化，反應條件溫和，產物成分較為單一，副產物較少。

本發明為解決上述技術問題采用如下技術方案，一種嘌呤/嘧啶核苷磷酸化酶串聯表達工程菌，其特征在于：將嘌呤/嘧啶核苷磷酸化酶基因導入宿主大腸桿菌中進行串聯表達獲得嘌呤/嘧啶核苷磷酸化酶串聯表達工程菌，該嘌呤/嘧啶核苷磷酸化酶串聯表達工程菌為U-P-P(BL21(DE3)-pETDuet-1-deoD-udp) Escherichia coli U-P-P(pETDuet-1-deoD-udp)，保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏日期為2019年9月10日，保藏編號為CCTCC NO：M 2019706。

進一步限定，所述嘌呤/嘧啶核苷磷酸化酶編碼基因源于大腸桿菌，其表達載體包括但不局限于pACYCDuet-1、pETDuet-1、pCDFDuet-1或pRSFDuet-1，所述大腸桿菌為以下任意一種：DH5α、BL21(DE3)或MG1655。