[發明專利]一種分離的CYP450蛋白及其編碼基因與應用

有效

• 申請號: 202110423318.0
• 申請日: 2021-04-20
• 公開（公告）號: CN113265381B
• 公開（公告）日: 2022-07-08
• 發明（設計）人: 高偉;王家典;蘇平
• 申請（專利權）人: 首都醫科大學
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/53;C12N15/81;C12P33/00
• 代理公司: 北京天奇智新知識產權代理有限公司 11340
• 代理人: 陸軍

本發明涉及一種雷公藤細胞色素p450氧化酶CYP81AM1，以及該酶在合成松香烷型二萜類化合物中的應用。所述酶具有催化脫氫松香酸進一步氧化生成15?羥基脫氫松香酸的生物學功能。本發明還涉及所述酶的編碼基因、包含所述基因表達載體及工程菌，本發明推動了雷公藤甲素生物合成途徑全解析，對雷公藤甲素等二萜化合物的合成調控具有重要的意義。

技術領域

本發明涉及一種分離的蛋白，即雷公藤細胞色素p450氧化酶CYP81AM1，以及編碼所述酶的多核苷酸，所述酶可用于二萜類化合物(松香烷型二萜類化合物，如催化15-羥基脫氫松香酸生物合成)的生物合成，屬于藥用植物基因工程領域。

背景技術

雷公藤(Tripterygium wilfordii Hook.f.)是衛矛科雷公藤屬多年生藤本植物，具有良好的殺蟲活性，在抗炎、抗腫瘤和免疫抑制等方面廣泛應用。萜類成分是雷公藤的主要活性成分，其中松香烷型二萜類化合物雷公藤甲素被公認為雷公藤中最主要活性成分之一，多個雷公藤甲素衍生物已進入臨床研究階段。從中藥的活性成分中開發新藥是一種很有潛力的方式，然而由于植物的生長緩慢且藥用成分含量很低，大大限制了其應用。近年來利用合成生物學技術設計和改造微生物菌株來生產天然活性產物已經成為一種極具潛力的獲取方法。

萜類化合物在高等植物中的合成途徑主要有兩種，位于細胞質中的甲羥戊酸(MVA)途徑和位于質體中的2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸(MEP)途徑,通過以上兩個途徑生成萜類的共同前體異戊烯基焦磷酸(IPP)及其同分異構體二甲基丙烯基焦磷酸(DMAPP)；在異戊烯轉移酶的催化下，3個IPP分子與1個DMAPP分子發生首尾相連，生成GGPP前體，再由二萜合酶(Diterpene synthase)催化形成二萜烯中間體母核結構(Su P.*,Gao L.H.*,LiuS.,et al.Probing the function of protein farnesyltransferase in Tripterygiumwilfordii [J].Plant Cell Reports,2019,38(2):211-220)，然后母核在CYP450酶、轉移酶等后修飾酶的作用下生成復雜多樣的二萜類活性化合物。

細胞色素P450(cytochrome P450,簡稱P450)是一類以血紅素為輔基的B族細胞色素超家族蛋白酶。植物細胞色素P450具有廣泛的催化活性，在植物體內催化多種初級和次級代謝反應，被人們稱為“萬能的生物催化劑”。在真核生物中，P450酶往往是通過N-端的疏水序列或者疏水環與線粒體內膜或內質網膜結合，因此很難分離純化，其次由于P450蛋白質種類的多樣性和底物催化的專一性，導致只有極少數的CYP450基因功能被鑒定。

蘇平等人成功鑒定了雷公藤甲素生物合成途徑首個CYP450基因(CYP728B70)，體外酶促研究證實其具備連續兩步氧化雷公藤甲素二萜烯阿松香三烯形成脫氫松香酸的生物學功能 (TuL,SuP,et al.Genome of Tripterygium wilfordii and identificationof cytochrome P450 involved in triptolide biosynthesis.[J].NatureCommunications,2020.)。

發明內容

本發明的第一方面，提供了一種分離的蛋白，所述蛋白參與二萜類化合物的生物合成，尤其是松香烷型二萜類化合物，如15-羥基脫氫松香酸。

本發明中，所述分離的蛋白，是一種細胞色素p450氧化酶(或稱為雷公藤細胞色素p450 氧化酶，以下可用CYP81AM1表示)，為一種參與雷公藤二萜類化合物的生物合成，尤其是雷公藤甲素生物合成的關鍵酶，所述酶具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，或SEQ IDNO： 2所示氨基酸序列經取代、缺失或增加一個或多個氨基酸其功能相同的肽。