[發明專利]一種內切纖維素酶基因egI及其編碼的蛋白與應用

有效

• 申請號: 202110419551.1
• 申請日: 2021-04-19
• 公開（公告）號: CN113151326B
• 公開（公告）日: 2022-06-10
• 發明（設計）人: 沈其榮;劉東陽;劉志穎;馬磊;孔志堅
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12N15/56
• 分類號: C12N15/56;C12N9/42;C12N15/81;C12N1/19;C12R1/84
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 吳爽;徐冬濤

本發明公開了一種內切纖維素酶基因egI及其編碼的蛋白與應用。本發明的內切纖維素酶基因egI，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示所示；該基因編碼的蛋白即為內切纖維素酶EGI。從EGI的酶促反應動力學分析可得其水解CMC的最大反應速率達22.2 mg·min^?1。酶學結果分析表明：在pH 3?4時，EGI水解CMC每分鐘可產生的還原糖含量最高值高達21.4 mg·mL^?1，屬于酸性內切纖維素酶；溫度達100℃時，EGI水解CMC每分鐘產生的還原糖含量可達12.4 mg·mL^?1，在高溫下仍有較強的活性。本發明為農業廢棄物的資源化利用、生態農業的發展提供了理論基礎和技術保障。

技術領域

本發明屬于酶學工程領域，具體涉及一種內切纖維素酶基因egI及其編碼的蛋白與應用。

背景技術

環境以及資源問題是當今社會中人類所面臨的最重要且嚴峻的危機之一。地球生態環境中，具有可再生能力的同時兼具廣泛分布且廉價特性的資源只有纖維素。全球植物每年通過光合作用產生的干物質近200億噸，其中纖維素含量比例超過50％。目前對于這類可再生生物資源的降解利用卻受限于木質纖維素的限制。纖維素外圍被木質素層包圍，且高結晶構造不溶與水，因此很難將其直接水解成可利用的葡萄糖，到目前為止仍然沒有找到適宜的利用辦法。伴隨著世界人口驟長、資源短缺等一系列社會問題日益顯著，為解決目前世界能源危機、糧食短缺、環境污染等熱點社會問題，探究如何利用纖維素酶發展生物工業，實現纖維素的生物轉化與利用是具有重要現實意義。現階段研究表明，僅憑化學法和物理法都難以將其完全降解，酶解法擁有低能耗、反應條件溫和、環境友好等優點，使之逐漸成為各國研究人員關注熱議的焦點。但纖維素酶的工業化生產與市場推廣應用現狀并不樂觀，目前纖維素酶依然存在較低的酶活利用率以及高昂的生產成本。

內切纖維素酶水解纖維素的生物機制很關鍵，內切纖維素酶隨機切割纖維素長鏈內部的非結晶區，進而降低纖維素結構的完整性，使纖維素水解產生一定量的小分子多糖。其中內切纖維素酶優先作用于無定型纖維素，并從纖維素分子內部進行水解。在木霉纖維素酶系中，微生物內部的調控機制管控調節各組分纖維素酶比例，很難以調控培育條件等方式完成人工調節。而在纖維素酶不同的工業生產中對各組分比例往往有著不相同的要求，舉例在紡織品水洗環節中，需求較高相對活性的內切纖維素酶，這種情況下，由木霉直接合成的纖維素酶很難滿足工業批量化生產的需求。

本專利通過構建重組畢赤酵母實現內切纖維素酶基因egI的高效表達，對于提高農作物秸稈的綜合利用具有重要的意義，并為實際生產提供理論依據。

發明內容：

本發明的目的是針對現有技術，一種內切纖維素酶基因egI及其編碼的蛋白與應用。

本發明的目的可通過以下技術方案實現：

一種內切纖維素酶基因egI，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本發明還保護前文所述的內切纖維素酶基因egI編碼的蛋白，即內切纖維素酶EGI。

優選的，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本發明還保護含有前文所述的內切纖維素酶基因egI的重組表達載體。

優選的，所述重組表達載體為重組質粒pPICZαA-egI。

優選的，首先擴增獲得內切纖維素酶基因egI的編碼區序列，接著運用雙酶切和酶連的方法構建重組質粒pPICZαA-egI。

具體的，以稻草堆肥樣品為原料提取總RNA，反轉錄獲取內切葡聚糖酶基因egI的cDNA；以cDNA為模板，利用PCR擴增法獲得的egI基因的完整序列；采用雙酶切和酶連的方法，將完整的egI基因插入到pPICZαA表達載體上，獲得重組表達質粒pPICZαA-egI。

本發明還保護含有前文所述的內切纖維素酶基因egI的重組工程菌。