[發明專利]一種免疫細胞體外誘導擴增、凍存和復蘇的方法

在審

• 申請號: 202110416977.1
• 申請日: 2021-04-19
• 公開（公告）號: CN113122498A
• 公開（公告）日: 2021-07-16
• 發明（設計）人: 安雯婷;郭麗娜
• 申請（專利權）人: 河北醫科大學第二醫院
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783;C12N5/078;A01N1/02
• 代理公司: 合肥匯融專利代理有限公司 34141
• 代理人: 張雁

1.一種免疫細胞體外誘導擴增、凍存和復蘇的方法，其特征在于，所述一種免疫細胞體外誘導擴增、凍存和復蘇的方法包括以下步驟：

(1)培養容器包被處理：將CD16抗體包被培養容器，獲取包被后的培養容器備用；

(2)單個核細胞激活培養：采用免疫細胞激活培養基，將單個核細胞置于上述步驟(1)中包被后的培養容器中，進行激活培養24-36h，得激活細胞備用，其中免疫細胞激活培養基包括無血清淋巴細胞培養基、自體血漿、IL-2、γ干擾素和沙培林；

(3)初步誘導擴增：采用初步擴增培養基對上述激活細胞進行初步擴增培養，且在培養過程中向培養基中加入EPO，其中初步擴增培養基包括無血清淋巴細胞培養基、自體血漿、IL-10；

(4)二次擴增：采用二次擴增培養基將上述初步擴增后的免疫細胞進行二次擴增，且在擴增過程中向培養基中加入IL-2，其中二次擴增培養基包括無血清淋巴細胞培養基、自體血漿、甲狀旁腺激素，二次擴增結束后得大量激活免疫細胞；

(5)冷凍處理：將上述激活免疫細胞采用凍存液進行凍存，得凍存免疫細胞；

(6)細胞復蘇：將上述凍存免疫細胞加入溫度為40-45℃的凍存液混合攪拌溶解，溶解后對溶液進行離心，得復蘇的免疫細胞。

2.根據權利要求1所述的一種免疫細胞體外誘導擴增、凍存和復蘇的方法，其特征在于：所述步驟(2)中免疫細胞激活培養基中自體血漿的含量為7體積％-13體積％、IL-2濃度為700-1300IU/ml、γ干擾素的濃度為300-400U/mL、沙培林濃度為0.007-0.013KE/ml。

3.根據權利要求1所述的一種免疫細胞體外誘導擴增、凍存和復蘇的方法，其特征在于：所述步驟(3)中初步擴增培養基中自體血漿的含量為15體積％-22體積％、IL-10的含量為500-1000U/ml。

4.根據權利要求1所述的一種免疫細胞體外誘導擴增、凍存和復蘇的方法，其特征在于：所述步驟(3)中EPO的添加量為1.2-2.0ng/ml，且EPO在初步誘導擴增2h后添加。

5.根據權利要求1所述的一種免疫細胞體外誘導擴增、凍存和復蘇的方法，其特征在于：所述步驟(4)中二次擴增培養基中自體血漿的含量為20體積％-24體積％、甲狀旁腺激素的含量為0.52-0.78ug/ml。

6.根據權利要求1所述的一種免疫細胞體外誘導擴增、凍存和復蘇的方法，其特征在于：所述步驟(4)中IL-2的添加量為500-600IU/ml，且IL-2在二次擴增2h后添加。

7.根據權利要求1所述的一種免疫細胞體外誘導擴增、凍存和復蘇的方法，其特征在于：所述步驟(5)中凍存液包含5-8％的DMSO、1-2％的HSA、10-15％的自體血漿、1-2％氨基乙醇，余量為無血清淋巴細胞培養基。

8.根據權利要求1所述的一種免疫細胞體外誘導擴增、凍存和復蘇的方法，其特征在于：當所述分化的免疫細胞的CD56的表達超過90％時，進行步驟(4)中的二次擴增。

9.根據權利要求1所述的一種免疫細胞體外誘導擴增、凍存和復蘇的方法，其特征在于：所述免疫細胞為自然殺傷細胞。