[發(fā)明專利]一種基于CRISPR/Cas9技術(shù)的Ahnak2基因敲除動(dòng)物模型的構(gòu)建方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110411363.4
• 申請(qǐng)日: 2021-04-16
• 公開（公告）號(hào): CN113088521A
• 公開（公告）日: 2021-07-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 丁克越;唐霞
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 河南省人民醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12N15/113
• 分類號(hào): C12N15/113;C12N15/55;C12N15/85;C12N15/89;A01K67/027;A01K67/02
• 代理公司: 北京科家知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11427
• 代理人: 宮建華

本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，涉及一種基于CRISPR/Cas9技術(shù)的Ahnak2基因敲除動(dòng)物模型的構(gòu)建方法，包括靶向小鼠Ahnak2基因的sgRNA載體構(gòu)建、sgRNA的體外轉(zhuǎn)錄、F0代小鼠獲取及鑒定、F1代雜合小鼠獲取及鑒定、純合后代的獲取等過程構(gòu)建Ahnak2基因敲除動(dòng)物模型，所構(gòu)建的動(dòng)物模型，解決了傳統(tǒng)基因敲除技術(shù)中基因脫靶率高、動(dòng)物成活率低的問題，通過篩選更為高效的靶向小鼠Ahnak2基因的sgRNA載體，并對(duì)進(jìn)一步降低脫靶率，提高小鼠后代陽性率及模型構(gòu)建的成功率，經(jīng)過6代純合自交依然能夠獲得純合后代，使得本發(fā)明方法構(gòu)建的動(dòng)物模型具有良好的穩(wěn)定性，在心臟病、結(jié)直腸癌、子宮癌等腫瘤機(jī)理研究及藥物開發(fā)領(lǐng)域具有重要應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體涉及利用基因修飾技術(shù)制作基因敲出動(dòng)物模型的領(lǐng)域，更具體涉及一種基于CRISPR/Cas9技術(shù)的Ahnak2基因敲除動(dòng)物模型的構(gòu)建方法。

背景技術(shù)

CRISPR/Cas系統(tǒng)是一種來源于細(xì)菌獲得性免疫的由RNA介導(dǎo)Cas蛋白對(duì)目的基因進(jìn)行靶向修飾的技術(shù)。經(jīng)過研究者改造過的TypeⅡCRISPR/Cas9系統(tǒng)自2013年成功敲除哺乳動(dòng)物細(xì)胞后，現(xiàn)在已經(jīng)被應(yīng)用于多種模式生物的基因敲除。CRISPR/Cas9系統(tǒng)載體構(gòu)建簡單快速，易操作，省時(shí)省力周期短，且?guī)缀鯇?duì)所有物種都適用。CRISPR/Cas9和TALEN(Transcription Activator-like Effector Nucleases)的作用都是實(shí)現(xiàn)染色體上特定位點(diǎn)的雙鏈斷裂，然后引發(fā)自主損傷修復(fù)，修復(fù)會(huì)引發(fā)插入或缺失，從而造成基因序列永久的缺失，即基因敲除。針對(duì)每個(gè)基因，CRISPER/Cas9只需要構(gòu)建一個(gè)sgRNA(singleguideRNA)，而且效率都很高，序列選擇限制較小，只需要基因組上出現(xiàn)GG就可以。與zinc-finger nuclease(ZFN)和TALEN相比，CRISPER/Cas9引起的脫靶效應(yīng)較高，但是使用成對(duì)sgRNA/Cas9-D10A截短的sgRNA或者FoKI-dCas9可以極大的降低脫靶效應(yīng)。目前，CRISPER/Cas9主要應(yīng)用于基因定點(diǎn)突變(插入或缺失)、基因定點(diǎn)敲除、兩位點(diǎn)同時(shí)突變、小片段的缺失、編碼基因和非編碼基因(lncRNA、microRNA)的靶向基因敲除。

Ahnakβ位于11q12.2，長1108bp，由6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子組成，其中開放閱讀框(ORF)長450bp(301-750nt)，編碼含有149個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)大小約為16.0KD。它是Ahnak的第二個(gè)轉(zhuǎn)錄剪接體。第一個(gè)轉(zhuǎn)錄剪接體Ahnakα的cDNA為18815個(gè)堿基，編碼一個(gè)680KD的巨型蛋白。通過BLAST比對(duì)，發(fā)明人所在研究團(tuán)隊(duì)首次發(fā)現(xiàn)Ahnakα與Ahnakβ的N端是一樣的，但是Ahnakβ的C端與α完全不一樣。因?yàn)橐阎狝hnakα具有控制心肌收縮的作用，提示Ahnakβ可能與心臟發(fā)育相關(guān)。研究表明Ahnak2基因在小鼠成體中心臟和腸的表達(dá)最強(qiáng)，其次在子宮的表達(dá)較強(qiáng)，在脾臟和腎有微弱的表達(dá)。因此，基于該前期研究成果構(gòu)建Ahnak2基因敲除的動(dòng)物模型，對(duì)于心臟病、結(jié)直腸癌、子宮癌的發(fā)病機(jī)理的研究及藥物開發(fā)具有極為重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種簡單、高效且成功率高的基于CRISPR/Cas9技術(shù)的Ahnak2基因敲除動(dòng)物模型的構(gòu)建方法。

基于上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

第一方面，本發(fā)明提供一種基于CRISPR/Cas9技術(shù)的Ahnak2基因敲除動(dòng)物模型的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

S1：靶向小鼠Ahnak2基因的sgRNA載體構(gòu)建

以Ahnak2內(nèi)含子位置作為敲除區(qū)域，根據(jù)靶基因Ahnak2設(shè)計(jì)一對(duì)相應(yīng)的sgRNA序列，sgRNA序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；

S2：sgRNA的體外轉(zhuǎn)錄

將步驟S1中合成的一對(duì)sgRNA和cas9 mRNA進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄；