[發明專利]一種用于檢測肌酸激酶同工酶的微流控芯片比色檢測方法和試劑盒

在審

• 申請號: 202110410703.1
• 申請日: 2021-04-14
• 公開（公告）號: CN113311161A
• 公開（公告）日: 2021-08-27
• 發明（設計）人: 高志賢;王瑜;韓鐵;彭媛;李雙;韓殿鵬;任舒悅;秦康;陳夢夢
• 申請（專利權）人: 軍事科學院軍事醫學研究院環境醫學與作業醫學研究所
• 主分類號: G01N33/573
• 分類號: G01N33/573;G01N33/58;G01N21/78
• 代理公司: 北京思創大成知識產權代理有限公司 11614
• 代理人: 高爽

本發明屬于蛋白檢測領域，涉及一種用于檢測肌酸激酶同工酶的微流控芯片比色檢測方法和試劑盒。該方法包括以下步驟：S1.制備線性聚丙烯酰胺?DNA聚合物；S2.金納米顆粒的合成和修飾；S3.微流控芯片的設計和組裝；S4.DNA水凝膠的合成；S5.檢測。本發明利用DNA水凝膠對目標物進行檢測，穩定性好，反應特異性強，可以實現可視化檢測。利用微流控芯片進行檢測，實現了便攜性定量檢測的目的。

技術領域

本發明屬于蛋白檢測領域，具體地，涉及一種用于檢測肌酸激酶同工酶的微流控芯片比色檢測方法和試劑盒。

背景技術

急性心肌梗死(Acute myocardial infarction，AMI)是全球范圍內引起死亡的常見原因。根據世衛組織統計，在2015年1790萬死于心血管疾病的病例中，約有890萬人死于缺血性心臟病，而急性心肌梗死是其主要病因，且呈年輕化趨勢。因此對急性心肌梗死進行快速有效的診斷具有重要的臨床意義。由于心肌梗死發病的突發性和不可預知性，迫切需要開發出可以在任何場合快速有效診斷的便攜式檢測手段。

檢測體液中生物標志物的濃度是診斷急性心肌梗死的有效方法，具有較高的準確性和精密度。肌酸激酶同工酶(Creatine Kinase MB，CKMB)作為心臟生物標志物的一種，具有較高的特異性和敏感性，其值的連續監測還可用于判斷再梗死的發生。急性心肌梗死發生時，血液中CKMB濃度上升至正常值上限(20ng/mL，44kDa)的兩倍以上。在心梗發生的第4-6小時，血液中CKMB的含量開始上升，第24小時到達峰值，此時，其濃度可達正常值的10倍，在48-72小時恢復至正常水平。目前，有多種免疫測定方法已經用于生物標志物的檢測，包括表面等離子體共振、熒光、電化學。但是它們都需要高成本的設備和專業的技術人員，往往受限于實驗室等特定的操作環境，使其臨床應用受到一定的限制。因此對便攜式CKMB檢測方法的需要十分迫切。ELISA試劑盒可以滿足便攜的要求，已經廣泛應用于CKMB的篩查，但該方法存在孵育時間長、洗滌步驟多、靈敏度低等缺點。因此，本領域對準確、便攜且低成本的CKMB檢測方法的需求仍然十分迫切。

發明內容

針對現有技術的缺點，本發明要解決的技術問題是提供一種便攜、定量可拓展的基于DNA水凝膠的微流控芯片檢測方法，以實現對心肌梗死標志物肌酸激酶同工酶的即時檢測(POCT)。

為了實現上述目的，本發明提供一種用于檢測肌酸激酶同工酶的微流控芯片比色檢測方法，包括以下步驟：

(1)制備線性聚丙烯酰胺-DNA聚合物：分別將丙烯酰胺與S1和S2混合，真空干燥后，加入過硫酸銨溶液和四甲基乙二胺溶液，然后進行聚合反應，得到PS1和PS2；

S1的核苷酸序列為：5’-Acrydite-AAAAAGGGGGGTGGGTGGGGGATCTCGGAGGATGCTTTTAGGGGGTTGGG-3’(SEQ ID NO：1)；

S2的核苷酸序列為：5’-Acrydite-AAAAACCCTAAAAGCATC-3’(SEQ ID NO：2)；

(2)金納米顆粒的合成和修飾：將HAuCl₄水溶液在攪拌條件下加熱煮沸，然后迅速加入新鮮制備的檸檬酸鈉溶液，混合物繼續煮沸，得到金納米顆粒AuNPs；將BSA與AuNPs混合，震蕩孵育，然后通過離心再懸浮，得到BSA-AuNPs；

(3)微流控芯片的設計和組裝：使用Auto CAD軟件繪制芯片圖形，并據此制備微流控芯片，該芯片是使用軟光刻技術由聚二甲基硅氧烷制成的，具有液體進樣口，水凝膠加樣區，檢測區和液體通道；本發明微流控芯片可委托商購獲得；

(4)DNA水凝膠的合成：將PS1和AuNPs混合，將所得混合物在60-70℃和800-1200rpm條件下孵育，然后加入PS2，再孵育震蕩，以確保均勻混合；將體系冷卻至20-30℃，恒溫過夜，得到DNA水凝膠；

(5)檢測：