[發明專利]一株防治莖線蟲的猴假單胞菌及其發酵液和應用

有效

• 申請號: 202110406327.9
• 申請日: 2021-04-15
• 公開（公告）號: CN112831450B
• 公開（公告）日: 2022-07-12
• 發明（設計）人: 閆紅飛;劉賀;孟慶芳;趙娜;李令蕊;邸寶;房小力;郝曉宇;張文朝
• 申請（專利權）人: 河北農業大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;A01N63/27;A01P5/00;C12R1/38
• 代理公司: 石家莊國為知識產權事務所 13120
• 代理人: 郝曉紅

本發明涉及微生物技術領域，特別是涉及一株防治莖線蟲的猴假單胞菌及其發酵液和應用。該猴假單胞菌已于2020年12月15日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏編號為CGMCC No.21378；保藏地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號。該猴假單胞菌能夠有效防治莖線蟲，與5％的阿維菌素相比，該猴假單胞菌防效更好，繼代培養穩定，殺線蟲活性能夠穩定遺傳。該猴假單胞菌對植株生長安全，并對環境無害。

技術領域

本發明涉及微生物技術領域，特別是涉及一株防治莖線蟲的猴假單胞菌及其發酵液和應用。

背景技術

多年來，甘薯莖線蟲病是甘薯種植區嚴重的發生病害。甘薯莖線蟲對環境適應能力強，在干燥的環境中可生存1年以上。莖線蟲卵、幼蟲和成蟲能夠在甘薯塊中一起過冬，也可以在肥料和土壤中過冬。莖線蟲為內寄生，傳播途徑多，可在苗床、田間與貯藏期進行侵染。甘薯感染后其皮呈現褐色，有龜裂、糠心，極大影響了甘薯的品質和產量，給甘薯生產造成很大損失。但目前市面上能夠防治莖線蟲的有效藥劑很少，且以高毒化學藥劑為主，但對環境容易造成污染。因此，生物防治是對環境友好、安全、有效的發展方向，但至今缺乏有效的生防菌株。

發明內容

針對以上技術問題，本發明提供一株防治莖線蟲的猴假單胞菌及其發酵液和應用。該猴假單胞菌為內生拮抗菌，能夠有效防治莖線蟲，且對植株生長沒有影響，并對環境無害。

為解決上述技術問題，本發明實施例采用了如下的技術方案：

一方面，本發明實施例提供一株猴假單胞菌，其分類名稱為猴假單胞菌(Pseudomonas simiae)，于2020年12月15日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏編號為CGMCC No.21378；保藏地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號。

本發明所提供的猴假單胞菌從患根線蟲病且發病輕的楸樹樹苗中分離得到，屬于假單胞菌屬，為內生拮抗菌，能夠有效防治莖線蟲，與5％的阿維菌素相比，該猴假單胞菌防效更好，且繼代培養穩定，殺線蟲活性可穩定遺傳。并且該猴假單胞菌對植株生長沒有影響，并對環境無害。該猴假單胞菌的GYRB引物序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示，RPOB引物序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示，PMD-19T質粒序列如SEQ ID NO.5所示，GYRB2、GYRB3的序列如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示，RPOB1、RPOB2、RPOB3的序列如SEQ IDNO.8～SEQ ID NO.10所示。

該猴假單胞菌的篩選方法具體包括以下步驟：

選擇根結線蟲發病輕的楸樹樹苗，采集楸樹根部組織。將采集到的楸樹根部組織用無菌水洗凈泥沙及表面附著物，稱取0.02g放入超凈工作臺風干水分，在75％乙醇溶液中浸泡1min，無菌水沖洗1次，3％次氯酸鈉中浸泡1min，再用無菌水沖洗3～4次，取最后一次清洗的水涂布于LB平板檢測消毒是否徹底。消毒完全后的樣本在超凈工作臺風干后，剪碎置于無菌研缽中，加入1mL無菌水研磨成漿液。將研磨液轉移至無菌試管中，1000r/min離心1min去除大部分根部組織，取上清液進行梯度稀釋10^-1～10^-3，每個梯度取100μL菌液涂布于NA平板中，28℃培養箱倒置培養。待菌落長出之后，用平板劃線法反復純化，在平板表面得到單菌落，4℃下保存備用。

第二方面，本發明實施例還提供上述猴假單胞菌在制備防治莖線蟲的生防菌劑中的應用。

該猴假單胞菌具有殺滅莖線蟲的作用，且對植株生長沒有影響，并對環境無害，可制成生防菌劑用于在農業中防治莖線蟲。

第三方面，本發明實施例還提供一種猴假單胞菌發酵液，其制備方法包括以下步驟：將上述猴假單胞菌在NA培養基上劃線培養，26～30℃培養24～36h，挑取單菌落接種于NB培養基中，在26～30℃、180～220rpm/min搖床條件下培養48～60h，然后將培養液固液分離，即得所述猴假單胞菌發酵液。