[發明專利]一種增強鏈霉菌基因組編輯效率的方法及其應用

有效

• 申請號: 202110403824.3
• 申請日: 2021-04-15
• 公開（公告）號: CN113278645B
• 公開（公告）日: 2022-06-24
• 發明（設計）人: 毛旭明;劉一帆;王凱
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N15/76
• 分類號: C12N15/76;C12N15/65;C12N15/55;C12N15/34
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 趙杭麗

本發明提供一種增強鏈霉菌基因組編輯效率的方法及其應用。通過添加控制Cas9活性的元件，實現在轉錄、翻譯和蛋白質水平上對Cas9蛋白活性的三重控制，抑制Cas9蛋白對鏈霉菌的細胞毒性，提高鏈霉菌中質粒的轉化效率，在誘導條件下又能實現高效基因編輯。本發明建立了一個既受到化學小分子誘導，又受抑制蛋白調控的基因編輯系統，抑制Cas9體內毒性，在不影響編輯質粒轉化效率和宿主細胞自身生長代謝的前提下，實現遺傳元件的高效導入和后續基因的高效編輯。小分子化學誘導劑添加方便，能夠實現基于雙鏈斷裂、定向修復的基因組高效精準編輯。本發明可應用于包含模式或工業鏈霉菌在內的鏈霉菌基因工程和遺傳修飾改造。

技術領域

本發明屬于基因工程和基因遺傳修飾領域，涉及一種增強鏈霉菌基因組編輯效率的方法，是一種高效的誘導型鏈霉菌基因組編輯方法，明確地說，涉及在鏈霉菌中利用控制Cas9 活性實現增強基因轉化效率和編輯效率的方法及應用。

背景技術

CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas(CRISPR-associated) 系統是在原核生物中發現的原核生物特有的免疫系統。該系統的主要功能是伴隨有特異性靶向序列的RNA介導(single-guide RNA，sgRNA)，對外源侵入的DNA識別并降解，引起外源侵入的DNA功能缺失導致其失活。出于如此特征，CRISPR/Cas9系統被開發為一種針對特異性位點的基因定向編輯技術，具有效率高、易操作、投資少等公認的優勢。該系統近幾年被認為是分子機制解剖和基因表達控制最強大的基因組編輯工具包，并且還用于微生物代謝工程，巨型染色體構建甚至難以遺傳操縱的微生物。總而言之，CRISPR/Cas9系統是十分強大的基因編輯系統。

CRISPR/Cas9系統可對目的基因進行精確且高效的編輯。將外源的DNA指引到宿主細胞染色體的特異性位點上，實現定向基因編輯。該系統首先利用設計的引導sgRNA介導Cas9蛋白與目的位點產生特異性結合，完成目標DNA的特異性切割，再通過同源重組或非同源末端連接的方式自我修復，從而實現基因的敲除、敲入等。

然而，CRISPR/Cas9系統的脫靶效應和毒性效應會極大程度地妨礙其應用。Cas9毒性在微生物尤其是原核生物的可見后果是轉化子的急劇減少。因此，如何調控CRISPR/Cas9系統的毒性，實現該系統在微生物中的高效導入、高效基因編輯和減少脫靶效應，是目前面臨的一大難題。

鏈霉菌屬于放線菌，是一種絲狀細菌。該屬細菌是目前臨床藥物的重要來源，50％以上的天然產物藥物均是鏈霉菌生產。但大部分鏈霉菌，特別是工業生產用鏈霉菌的遺傳操作系統還不成熟，部分工業鏈霉菌甚至無法應用CRISPR/Cas9系統來開展基因編輯。究其原因，除了工業鏈霉菌本身的遺傳操作效率低下原因外，CRISPR/Cas9系統對鏈霉菌的細胞毒性也是重要原因。目前很少有開發的可調控鏈霉菌CRISPR/Cas9系統，或者開發的調控系統單一，比如僅僅在轉錄或者翻譯層次，調控效應不明顯；利用光誘導調控Cas9活性，條件控制和操作難度大，對基因編輯效率難以有效掌控。

目前有研究表明，在鏈霉菌中發現一種由硫鏈絲菌素誘導控制下游基因轉錄開關的誘導型啟動子tipAp，可作為CRISPR/Cas9編輯系統中抑制Cas9蛋白過表達的調控元件。并可以通過人為添加硫鏈絲菌素，誘導tipAp啟動子開啟轉錄，在編輯過程中實現Cas9表達水平的恢復，達到在轉錄水平控制Cas9活性的目的。

另一方面相關研究的報導中，發現一種長度達85bp的茶堿依賴性核糖體開關，在不存在茶堿條件下轉錄出的mRNA上的5’-非編碼區存在特殊的高級結構，可以阻止下游編碼基因表達的mRNA與核糖體結合，抑制下游編碼基因對應的多肽鏈的合成使蛋白表達處于低水平。在茶堿誘導下可以解開高級結構，因此加入茶堿后可產生下游編碼基因對應的多肽鏈的誘導表達，并且比抑制狀態下提高百倍。這種遺傳工具可實現在翻譯水平上控制Cas9活性，用于轉化效率的控制。