[發(fā)明專利]一株工程菌及其應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110400745.7
• 申請日: 2021-04-14
• 公開（公告）號: CN113308423B
• 公開（公告）日: 2023-01-31
• 發(fā)明（設計）人: 趙哲;喻飛;金興坤;陳泓迅;夏思瑤;李舒馨;雷天影
• 申請（專利權）人: 河海大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12N9/24;C12P19/00;C12R1/19
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 柏尚春

本發(fā)明公開了一株工程菌及其應用，該大腸桿菌工程菌株保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏時間為2021年3月25日，保藏編號為CCTCC NO：M 2021282。該基因工程菌株能夠生產(chǎn)海洋弧菌來源的瓊脂糖酶，所生產(chǎn)的瓊脂糖酶具有降解瓊脂中瓊脂糖的活性，可利用該工程菌株生產(chǎn)瓊脂糖酶應用于酶解法制備瓊脂寡糖等活性產(chǎn)物。

技術領域

本發(fā)明涉及一株菌及其應用，尤其涉及一株工程菌及其應用。

背景技術

瓊脂是由海洋藻類中提取的一類膠狀多糖，瓊脂糖(Agarose)是其主要組成成分之一。瓊脂糖是由α-L-半乳糖和β-D-半乳糖重復單元構成的瓊脂多糖；部分微生物可通過瓊脂糖酶(Agarase)生化酶解作用將瓊脂糖水解為更小分子量的瓊脂寡糖，從而可被生物體進一步分解利用，這也是海洋微生物碳源利用的方式之一。依據(jù)水解糖苷鍵的不同瓊脂糖酶分為α-瓊脂糖酶和β-瓊脂糖酶，其中β-瓊脂糖酶可水解多糖的β(1，4)糖苷鍵從而產(chǎn)生具有β-D-半乳糖還原性殘基末端的新瓊寡糖(Neoagaro oligosaccharides) 等。瓊脂經(jīng)水解作用可獲得二糖、四糖、六糖、八糖等瓊脂寡糖；瓊脂寡糖具有抗氧化、抗炎、抗輻射、降血糖等多種生物學活性，目前可基于化學方法和酶解方法水解瓊脂獲得該類低聚糖產(chǎn)物，廣泛應用于食品、醫(yī)藥、化工等領域；化學方法主要通過強酸或氧化還原法破環(huán)瓊脂糖苷鍵獲得新低聚產(chǎn)物，該類方法具有專一性(穩(wěn)定性)差，反應條件苛刻等劣勢，同時還帶來一定的環(huán)境污染問題。與此類方法相比，酶解法利用瓊脂糖酶特異性識別底物水解瓊脂糖，有利于特定寡糖的大量制備，酶促反應具有一定的穩(wěn)定性及環(huán)保性。酶解法利用的瓊脂酶大多分離自微生物，或利用基因工程方法重組表達獲得。

發(fā)明內容

發(fā)明目的：本發(fā)明所要解決的技術問題是彌補現(xiàn)有技術的不足，構建獲得一株生產(chǎn)瓊脂糖酶的工程菌，且能高效水解瓊脂中的瓊脂糖。

技術方案：本發(fā)明的工程菌，包括一株大腸桿菌Vas1-1339菌株，具有卡那霉素抗性；保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，分類命名為Escherichia coli BL21-Vasl-1339，保藏時間為2021年3月25日，保藏編號為CCTCC NO：M 2021282，保藏地址為：中國湖北省武漢市武昌區(qū)珞珈山路16號武漢大學。

本發(fā)明利用生物工程技術在大腸桿菌中表達弧菌瓊脂糖酶基因，證明該基因表達的瓊脂糖酶能夠獨立發(fā)揮瓊脂糖酶水解活性；可作為生物工具應用于酶解方法水解瓊脂糖，從而獲得低聚糖產(chǎn)物。

本發(fā)明的工程菌在生產(chǎn)瓊脂糖酶中的應用。

在生產(chǎn)瓊脂糖酶中的應用包括如下步驟：

(1)將工程菌單克隆培養(yǎng)；

(2)擴大培養(yǎng)，加入IPTG誘導表達，誘導后即可獲得氨基端帶有His6標簽的瓊脂糖酶。

進一步地，步驟(1)具體包括如下步驟：挑取工程菌株Vas1-1339單克隆于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。LB液體培養(yǎng)基含有50μg ml-1卡那霉素。

步驟(2)具體包括如下步驟：按1∶100稀釋菌液擴大培養(yǎng)至OD600達到0.3-0.4 左右，加入IPTG誘導表達，誘導后即可獲得氨基端帶有His6標簽的瓊脂糖酶。IPTG 使用濃度為10至100μM。瓊脂糖酶生產(chǎn)的最優(yōu)誘導時間：2至4h。

本發(fā)明的工程菌在生產(chǎn)瓊脂糖分解產(chǎn)物中的應用。

本發(fā)明的獲得的生產(chǎn)瓊脂糖酶的工程菌株在提取生物活性物質-瓊脂寡糖中的應用。本發(fā)明涉及的工程菌株能夠有效生產(chǎn)瓊脂糖酶，所生產(chǎn)的瓊脂糖酶具有水解瓊脂中瓊脂糖的能力，可應用于瓊脂糖分解產(chǎn)物(瓊脂寡糖)的生產(chǎn)等領域。

有益效果：與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下顯著優(yōu)點：