[發明專利]一種產四氫嘧啶工程菌株的構建及優化的方法

在審

• 申請號: 202110400206.3
• 申請日: 2021-04-14
• 公開（公告）號: CN113186143A
• 公開（公告）日: 2021-07-30
• 發明（設計）人: 康振;王陽;陳堅;堵國成;王道安
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12P17/12;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 張勇

本發明公開了一種產四氫嘧啶工程菌株的構建及優化的方法，屬于生物工程技術領域。本發明提供了能夠在低鹽條件下生產四氫嘧啶的大腸桿菌工程菌ECT?LA，該菌以大腸桿菌E.coli BL21(DE3)為基礎，包含由T7啟動子控制的四氫嘧啶合成基因簇ectABC及外源基因lysC^C932T和asd，并優化了四氫嘧啶的制備方法。本發明構建的重組大腸桿菌以葡萄糖為底物，分批補料發酵56h后，四氫嘧啶產量可達60g/L。

技術領域

本發明涉及一種產四氫嘧啶工程菌株的構建及優化的方法，屬于生物工程技術領域。

背景技術

四氫嘧啶(Ectoine)又稱依可多因，屬于天冬氨酸衍生物，作為一種相容溶質，可以協助細胞維持胞內外的滲透壓平衡；與蛋白質、核酸等大分子以及細胞膜相互作用以提高其穩定性，提高細胞承受高溫、高鹽度、高酸堿度、射線等極端環境的能力，已廣泛應用于新型化妝品、藥物、皮膚創傷修復以及器官移植維持等領域。

四氫嘧啶可以通過中度嗜鹽菌以“細菌擠奶”的方法生產，但這種工藝依賴高鹽脅迫的誘導，發酵周期長、提取困難且產量低，且不利于設備維護，同時由于四氫嘧啶的手性結構等問題，導致化學合成四氫嘧啶的難度與成本增加。為滿足日益增加的工業需求，構建系統代謝工程菌株以高產四氫嘧啶成為研究熱點，大腸桿菌作為目前微生物發酵工業中應用最廣泛的菌株成為重要選擇。謝希賢等(201510410080.2)通過構建具有特定基因型的E.coli W3110，包含來源于伸長鹽單胞菌ectABC基因；lysA、thrA、iclR三個基因缺陷型；具有lac啟動子控制的谷氨酸棒狀桿菌lysC基因；trc啟動子控制的ppc基因，葡萄糖為底物發酵20-28h后，四氫嘧啶產量達12-18g/L，但關鍵支路途徑導致氨基酸缺陷型，一定程度上會抑制菌體生長，給菌體造成一定的壓力，進而影響四氫嘧啶的生產。王鴻等(201810996222.1)通過構建具有特定基因型的E.coli MG1655，包括伸長鹽單胞菌ectABC基因；lysA基因缺陷型，L天冬氨酸鈉為底物，全細胞轉化法合成四氫嘧啶，2030h產量達2.53.5g/L，但全細胞催化法發酵工藝復雜，成本高。以上兩種大腸桿菌生產四氫嘧啶工藝產量不高，大大影響了四氫嘧啶相關研究進展以及商業應用的推進。

發明內容

本發明利用合成生物學技術和基因工程的手段，以大腸桿菌E.coli BL21(DE3)做為出發菌株，表達伸長鹽單胞菌來源四氫嘧啶合成途徑相關基因簇ectABC，實現四氫嘧啶的異源合成；并通過組合表達谷氨酸棒桿菌來源的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ppc、谷氨酸棒桿菌來源的丙酮酸羧化酶基因pyc、銅綠假單胞菌來源的天冬氨酸脫氫酶基因aspDH、谷氨酸棒桿菌來源并解除反饋抑制的天冬氨酸激酶基因lysC^C932T、伸長鹽單胞菌來源的天冬氨酸半醛脫氫酶基因asd、枯草芽孢桿菌來源的谷氨酸脫氫酶基因rocG，獲得了四氫嘧啶產量提高的重組大腸桿菌。

本發明提供了一種生產四氫嘧啶的大腸桿菌工程菌，表達了伸長鹽單胞菌來源的四氫嘧啶合成基因簇ectABC，所述四氫嘧啶合成基因簇ectABC包括二氨基丁酸轉乙酰基酶基因ectA、二氨基丁酸轉氨酶ectB和四氫嘧啶合成酶ectC，并表達了(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)中至少一種基因；其中：

(a)谷氨酸棒桿菌來源的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ppc；

(b)谷氨酸棒桿菌來源的丙酮酸羧化酶基因pyc；

(c)銅綠假單胞菌來源的天冬氨酸脫氫酶基因aspDH；

(d)谷氨酸棒桿菌來源的天冬氨酸激酶基因lysC；

(e)伸長鹽單胞菌來源的天冬氨酸半醛脫氫酶基因asd；

(f)枯草芽孢桿菌來源的谷氨酸脫氫酶基因rocG。

在一種實施方式中，所述大腸桿菌工程菌含有雙質粒表達系統；所述雙質粒包括pRSFDuet-1和pACYCDuet-1。