[發明專利]一種通過逆病毒獲取尿源誘導多能干細胞的方法

在審

• 申請號: 202110399203.2
• 申請日: 2021-04-13
• 公開（公告）號: CN113122505A
• 公開（公告）日: 2021-07-16
• 發明（設計）人: 佘凱芩
• 申請（專利權）人: 四川大學華西醫院
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/867;C12N5/071
• 代理公司: 成都華復知識產權代理有限公司 51298
• 代理人: 龐啟成

1.一種通過逆病毒獲取尿源誘導多能干細胞的方法，其特征在于：包括以下步驟；

步驟一、尿液收集及尿液原代細胞的獲??；

步驟二、逆轉錄病毒的包裝；

步驟三、尿液細胞的感染；

步驟四、尿液細胞的誘導；

步驟五、克隆細胞挑出；

步驟六、尿源iPSC鑒定。

2.如權利要求1所述的一種通過逆病毒獲取尿源誘導多能干細胞的方法，其特征在于，步驟三中，包括預先制備基質膠包被，具體步驟為：處理和分裝基質膠；使用時拿出分裝的基質膠用預冷的杜氏改良伊格爾培養基/漢氏F-12營養培養基按照1：100稀釋后均勻鋪到培養皿中，100mm培養皿8ml/皿，6孔板1ml/孔，12孔板500ul/孔；室溫下孵育至少1小時或37℃孵育至少30分鐘，使用前吸出剩余基質膠稀釋液。

3.如權利要求2所述的一種通過逆病毒獲取尿源誘導多能干細胞的方法，其特征在于，步驟三中包括步驟3.1：在6孔板的每個孔內鋪60000個尿液細胞；接種24小時后觀察尿液細胞匯合度約為30％，移去培養基加2ml新鮮的腎上皮細胞/間質細胞擴增培養基；隨后每孔加入第二步第4條中第一次收集的四因子的病毒上清共8ml；在37℃，95％CO2壞境中培養。

4.如權利要求3所述的一種通過逆病毒獲取尿源誘導多能干細胞的方法，其特征在于，步驟三中包括步驟3.2：12-16小時后，移去培養基，每孔加2ml新鮮的腎上皮細胞/間質細胞擴增培養基讓細胞恢復；8-12小時后，每孔加入第二步第4條中第二次收集的四因子的病毒上清共8ml，第二次感染；在37℃，95％CO2壞境中培養。

5.如權利要求4所述的一種通過逆病毒獲取尿源誘導多能干細胞的方法，其特征在于，步驟三中包括步驟3.3：二次感染12小時后，移去培養基加2ml新的腎上皮細胞/間質細胞擴增培養基；繼續培養，每天更換新鮮的腎上皮細胞/間質細胞擴增培養基。

6.如權利要求5所述的一種通過逆病毒獲取尿源誘導多能干細胞的方法，其特征在于，步驟三中包括步驟3.4：每天顯微鏡觀察被感染的尿液細胞。

7.如權利要求6所述的一種通過逆病毒獲取尿源誘導多能干細胞的方法，其特征在于，步驟三中包括步驟3.5：當尿液細胞形態改變明顯，達到80～90％匯合度時，使用0.25％胰酶消化，10ml的人腎上皮細胞/間質細胞擴增培養基終止消化后室溫200g離心5分鐘；棄去上清后用4ml腎上皮細胞/間質細胞擴增培養基重懸后計數，6孔板每孔鋪10萬個感染后的尿液細胞，添加人腎上皮細胞/間質細胞擴增培養基至2ml，此為培養第1天。

8.如權利要求1所述的一種通過逆病毒獲取尿源誘導多能干細胞的方法，其特征在于，步驟一中，尿液收集及尿液原代細胞的獲取包括以下步驟：

步驟1.1：尿液收集；步驟1.2尿液分離；步驟1.3尿液細胞擴增。

9.如權利要求1所述的一種通過逆病毒獲取尿源誘導多能干細胞的方法，其特征在于，步驟二中，逆轉錄病毒的包裝包括以下步驟：

步驟2.1：按1：3傳代鋪6孔板的5個孔的人胚腎293T細胞。

10.如權利要求9所述的一種通過逆病毒獲取尿源誘導多能干細胞的方法，其特征在于，步驟二中，逆轉錄病毒的包裝包括以下步驟：

步驟2.2：準備感染復合物，按照每孔200ul減血清培養基，4ug包裝載體pCL-Ampho，4ug基因表達載體(pMXs-OCT3/4，pMXs-KLF4,pMXs-SOX2,pMXs-cMyc或pMXs-GFP1)，24ul聚乙烯亞胺；混合后靜置15分鐘。