[發明專利]解淀粉芽孢桿菌脲酶在食品級枯草芽孢桿菌中的重組表達

在審

• 申請號: 202110399002.2
• 申請日: 2021-04-12
• 公開（公告）號: CN112921044A
• 公開（公告）日: 2021-06-08
• 發明（設計）人: 聶堯;徐巖;周霞
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N15/55
• 分類號: C12N15/55;C12N1/21;C12N15/75;C12N15/64;C12N9/80;A23L5/20;C12H1/15;C12R1/125
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 林娟

1.編碼脲酶的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.5或SEQ IDNO.6所示。

2.表達權利要求1所述基因的重組枯草芽孢桿菌，其特征在于，宿主選自：B.subtilisWB600、B.subtilis WB700、B.subtilis WB800或B.subtilis WB168，表達載體選自：pP43NMK、pHT43、pMA5或pTTB。

3.一種構建表達脲酶基因的重組枯草芽孢桿菌的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)將來源于Bacillus amyloliquefaciens IT-45的脲酶基因簇Ba-urease序列進行枯草芽孢桿菌密碼子優化、核糖體結合位點優化，獲得如SEQ ID NO.5所示的脲酶基因Ba-urease-1；

(2)在如SEQ ID NO.5所示的脲酶基因Ba-urease-1的基礎上，將ureC移置至ureA和ureB的上游，從而獲得序列如SEQ ID NO.6所示的脲酶基因Ba-urease-2，將其與表達載體pP43NMK連接，構建脲酶表達載體pP43NMK-Ure-2；

(3)將pP43NMK-Ure-2轉化至B.subtilis WB600中，獲得重組表達菌株B.subtilisWB600/pP43NMK-Ure-2。

4.一種表達脲酶基因的重組枯草芽孢桿菌，其特征在于，以B.subtilis WB600為宿主，以pP43NMK載體表達SEQ ID NO.6所示的脲酶基因。

5.應用權利要求4所述重組枯草芽孢桿菌制備脲酶的方法，其特征在于，包括以下步驟：

挑取重組枯草芽孢桿菌單菌落，接種于含有50μg/mL卡那霉素的5mL LB液體培養基中，在37℃、200r/min的搖床中振蕩培養10h；

按5％的接種體積分數，轉接于含有50μg/mL卡那霉素、4mmol/L Ni²⁺的100mL TB液體培養基中，在37℃、200r/min的搖床中振蕩培養8h，于28℃誘導培養42h。

6.攜帶權利要求1所述基因的載體。

7.解淀粉芽孢桿菌脲酶基因的食品級表達方法，其特征在于，對解淀粉芽孢桿菌IT-45來源的脲酶基因簇進行密碼子優化、核糖體結合位點優化重構以及將結構基因ureC調整至ureA、ureB上游，然后與表達載體連接，并轉化至食品級表達宿主，培養重組宿主使之表達脲酶。

8.權利要求1所述基因編碼的脲酶。

9.權利要求8所述脲酶在降解尿素中的應用。

10.根據權利要求9所述的應用，其特征在于，利用脲酶來降低或消除發酵食品和酒精飲料中的尿素含量以降低氨基甲酸乙酯。