[發明專利]一株惡臭假單胞菌突變菌株及其在6-羥基煙酸生物制備中的應用

有效

• 申請號: 202110398624.3
• 申請日: 2021-04-12
• 公開（公告）號: CN112877264B
• 公開（公告）日: 2022-04-05
• 發明（設計）人: 龔勁松;許正宏;商玉婷;史勁松;李恒
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12P17/12;C12R1/40
• 代理公司: 蘇州市中南偉業知識產權代理事務所(普通合伙) 32257
• 代理人: 王玉仙

本發明公開了一株惡臭假單胞菌突變菌株及其在6?羥基煙酸生物制備中的應用。本發明的惡臭假單胞菌突變菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期：2021年3月8日，保藏地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏號為CGMCC No.21876。本發明的突變株Pseudomonas putida S14 mut?5，活性為2.68U·mL^?1，是野生型的2.4倍。該菌株底物耐受性明顯提高，與腈水解酶聯合應用，可以轉化3?氰基吡啶累積獲得6?羥基煙酸54.5g·L^?1，其最適pH為6.0，相較于大多數偏好中性及堿性的煙酸脫氫酶，更適應工業生產條件，在工業應用上具有廣闊的開發前景。

技術領域

本發明涉及一株惡臭假單胞菌突變菌株及其在6-羥基煙酸生物制備中的應用，屬于微生物發酵技術領域。

背景技術

近年來，6-羥基煙酸作為高價值農業及化工中間體正受到廣泛關注。它可以合成低毒的吡啶甲胺類農藥，高效抑制植物真菌病害。在材料領域，6-羥基煙酸可作為獨特的材料參與反應，其衍生物可以作為橋聯單元完成能量轉移。但是，6-羥基煙酸很難由化學法快速高效合成。目前，通過有機合成法生產6-羥基煙酸通常是以富馬酸或蘋果酸為原料經過多步合成，其中需要的高溫和強酸強堿會引起環境污染，造成成本的增加，同時產物收率不高限制了其廣泛應用。因此，利用煙酸脫氫酶生物轉化煙酸合成6-羥基煙酸具有很大的潛力和商業價值并受到了較大關注。

煙酸脫氫酶能夠在不同程度上作用于煙酸和各種煙酸類似物。煙酸羥基化過程的實質是脫氫而非氧化，因為-OH中的O原子來自H₂O而不是空氣中的氧氣。來自不同菌株的煙酸脫氫酶具有不同轉化煙酸的代謝途徑，但是6-羥基煙酸始終是所有途徑的第一個產物。據報道，多數煙酸脫氫酶的最適溫度約為30-50℃，最適pH大多為7.0，底物耐受性約為10g·L^-1，例如熒光假單胞菌TN5、惡臭假單胞菌H9等來源煙酸脫氫酶。2006年從惡臭假單胞菌NA-1中發現了一種高活性(0.58U·mL^-1)的煙酸脫氫酶。2007年，假單胞菌BK-1中也發現了一種煙酸脫氫酶，其酶活為0.57U·mL^-1。2008年，發現惡臭假單胞菌BKC4的煙酸脫氫酶活性為0.53U·mL^-1。2009年，已報道的惡臭假單胞菌KT2440煙酸脫氫酶活性為0.34U·mL^-1。2017年，從腐魚中分離出的惡臭假單胞菌H9可以將煙酸轉化為6-羥基煙酸，活性為0.37U·mL^-1。據報道，P.fluorescens TN5可以在45h內轉化1.4M煙酸生成191g·L^-1 6-羥基煙酸，空時產率為0.57g·(g·h)^-1。

但是野生菌的性能通常不能滿足工業要求，所以一般需要采用多種策略來改善生物催化劑的催化性能。

發明內容

為解決上述技術問題，本發明從土壤挖掘出一株高產煙酸脫氫酶P.putida S14，將其應用于6-羥基煙酸的生產，并對產物進行鑒定。將P.putida S14野生菌進行ARTP誘變，采用基于高通量移液工作站和高通量微生物克隆篩選系統進行高通量篩選，得到酶活較高的突變株，進行最適pH、底物耐受性、傳代穩定性的檢測，并與腈水解酶級聯應用，生產6-羥基煙酸。

本發明的第一個目的是提供一株惡臭假單胞菌突變菌株，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期：2021年3月8日，保藏地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏號為CGMCC No.21876。

本發明的第二個目的是提供所述的惡臭假單胞菌突變菌株在催化煙酸生產6-羥基煙酸中的應用。

進一步地，所述的應用具體是采用所述的惡臭假單胞菌突變菌株發酵生產煙酸脫氫酶，以惡臭假單胞菌突變菌株細胞或煙酸脫氫酶為催化劑催化煙酸生產6-羥基煙酸。