[發明專利]腈水合酶賴氨酸突變體HBA-K1、編碼基因及應用

有效

• 申請號: 202110397915.0
• 申請日: 2021-04-14
• 公開（公告）號: CN113122526B
• 公開（公告）日: 2023-09-22
• 發明（設計）人: 柳志強;沈驥冬;蔡雪;金利群;徐建妙;鄭裕國
• 申請（專利權）人: 浙江工業大學
• 主分類號: C12N9/88
• 分類號: C12N9/88;C12N15/60;C12N15/70;C12N1/21;C12P17/12;C12R1/19
• 代理公司: 浙江千克知識產權代理有限公司 33246
• 代理人: 冷紅梅

本發明公開了一種本發明涉及一種腈水合酶突變體，具體涉及一種腈水合酶賴氨酸突變體HBA?K1及其編碼基因，含有該突變體編碼基因的質粒及重組菌，以及該腈水合酶賴氨酸突變體HBA?K1在催化有機腈化合物制備酰胺化合物中的應用。所述突變體HBA?K1的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，其最適pH為9.0，最適溫度為35℃。與野生酶HBA相比，突變腈水合酶HBA?K1的翻譯后自修飾效率和比活力得到了改良，可應用于生物催化生產丙烯酰胺、煙酰胺及其它高附加值的酰胺類化合物，化工纖維表面改性和堿性污水處理等生物技術領域。

(一)技術領域

本發明涉及一種腈水合酶突變體，具體涉及一種腈水合酶賴氨酸突變體HBA-K1及其編碼基因，含有該突變體編碼基因的質粒及重組菌，以及該腈水合酶賴氨酸突變體HBA-K1在催化有機腈化合物制備酰胺化合物中的應用。

(二)背景技術

腈水合酶能夠通過水和作用將各種有機腈化合物的氰基轉換成酰胺基，與化學水解法相比生物轉化法具有效率高、條件溫和、環境污染小、并能在無額外引入保護/修飾基團的情況下實現化學、區域和對映體選擇性等優點。為了在工業上利用腈水合酶催化生產丙烯酰胺、煙酰胺、吡嗪酰胺等酰胺類化合物，降低該酶的制造成本在酰胺化合物的制造成本中所占的比例尤為重要。具體而言，必須提高單位重量酶制備物中腈水合酶的含量。隨著生物技術的迅速發展，用基因工程技術手段來構建具有腈水合酶活性的基因重組菌株可以用來克服上述的缺點。此外，利用基因重組菌來表達腈水合酶可以定向表達腈水合酶，以避免催化反應過程中副反應的發生，確保酰胺類目標產物在產生的過程中不被部分水解，從而提高酰胺產品的產量和質量。

腈水合酶的基本結構單位是由α亞基和β亞基結合而成的二聚體，結構單位進一步結合形成4～12聚體(根據來源的物種不同而不同)而發揮活性。腈水合酶在表達翻譯的過程中需要攝入金屬離子(鐵離子或鈷離子)，并伴隨金屬離子配位發生的現象，其活性中心區域的2個半胱氨酸殘基在翻譯后發生氧化修飾。腈水合酶的翻譯后成熟的過程需要特定的分子伴侶來協助腈水合酶攝入金屬離子。但是，還沒有任何發明公開關于在沒有分子伴侶協助的情況下，鈷型腈水合酶能主動完成翻譯后修飾的實例，同時也沒有任何發明公開能人工調節腈水合酶翻譯后自修飾效率的具體方法。

(三)發明內容

本發明的目的在于提供一種堿性活力改良且無需共表達分子伴侶的鈷型腈水合酶突變體HBA-K1，含有該突變體編碼基因的質粒及重組菌，以及該腈水合酶賴氨酸突變體HBA-K1在催化有機腈化合物制備酰胺化合物中的應用。

本發明采用的技術方案是：

一種腈水合酶賴氨酸突變體HBA-K1，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。

SEQ?ID?NO.1序列如下：

本發明還涉及編碼所述的腈水合酶賴氨酸突變體HBA-K1的基因(hba-k1)。具體的，所述編碼基因核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。所述突變體HBA-K1的最適pH為9.0，最適溫度為35℃，比活力為630.2±27.7U/mg，鈷離子攝入率為0.76±0.02。

SEQ?ID?NO.2序列如下：

本發明還涉及含有編碼所述腈水合酶賴氨酸突變體HBA-K1的基因的質粒，以及利用該質粒獲得的含有編碼所述腈水合酶賴氨酸突變體HBA-K1的基因的重組菌。

本發明還涉及所述腈水合酶賴氨酸突變體HBA-K1在催化有機腈化合物制備酰胺化合物中的應用。

具體的，所述催化反應在35～40℃、pH8.5～9.0條件下進行。

優選的，所述有機腈化合物為3-氰基吡啶，所述酰胺化合物為3-吡啶甲酰胺。