[發(fā)明專利]一種創(chuàng)制地黃雜合突變體的方法及應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110397674.X
• 申請日: 2021-04-14
• 公開（公告）號: CN113355337B
• 公開（公告）日: 2023-06-20
• 發(fā)明（設計）人: 王豐青;左鑫;李欣容;孫瑞斌;孫紅正;苗春妍;杜家方;李烜楨;黃勇;張重義
• 申請（專利權）人: 河南農業(yè)大學;焦作市玖道種苗繁育有限公司
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12N15/84;A01H5/00;A01H6/00
• 代理公司: 鄭州三陽專利代理事務所(普通合伙) 41175
• 代理人: 范向南

1.一種創(chuàng)制地黃雜合突變體的方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）地黃總RNA的提取與反轉錄：取地黃塊根鮮樣置于液氮中冷凍后研磨，進行總RNA的提取，然后將提取的RNA反轉錄合成cDNA；

（2）地黃PDS基因的克隆：以擬南芥AtPDS3基因序列為參考，在已獲得的地黃轉錄組數據庫中進行同源比對篩選獲得地黃PDS基因作為CRISPR/Cas9的靶向基因，并命名為RgPDS1，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，根據RgPDS1的序列，設計一對特異性引物RgPDS1_F和RgPDS1_R，取反轉錄合成的cDNA，稀釋50倍后作為PCR擴增模板進行目的基因的克隆；

（3）靶位點的設計：根據PDS基因的序列在RgPDS1基因上設計靶位點，所述的靶位點序列如SEQ?ID?NO.2所示；

（4）構建地黃PDS基因的CRISPR/Cas9載體：根據靶序列信息合成一對反向互補的上下游引物，所述的引物核苷酸序列如SEQ?ID?NO.3所示的sgPDS_F和SEQ?ID?NO.4所示的sgPDS_R，根據靶位點或靶序列引物制備得到含靶序列的CRISPR/Cas9基因編輯系用載體；

（5）獲得地黃雜合突變體：將重組載體轉化農桿菌，并對地黃外植體進行遺傳轉化獲得突變植株。

2.如權利要求1所述的創(chuàng)制地黃雜合突變體的方法，其特征在于：所述步驟（2）中RgPDS1_F和RgPDS1_R的核苷酸序列分別如SEQ?ID?NO.?5和SEQ?ID?NO.6所示。

3.如權利要求2所述的創(chuàng)制地黃雜合突變體的方法，其特征在于：所述步驟（4）中根據靶位點或靶序列引物制備得到含靶序列的CRISPR/Cas9基因編輯系用載體的具體操作為，將上下游引物退火形成雙鏈后通過酶切連接法插入CRISPR/Cas9植物表達載體pKSE401，再次篩選出構建成功的重組質粒。

4.如權利要求3所述的創(chuàng)制地黃雜合突變體的方法，其特征在于：所述靶序列引物包含Bsal?I內切酶粘性末端。

5.如權利要求4所述的創(chuàng)制地黃雜合突變體的方法，其特征在于：所述的農桿菌為根癌農桿菌LBA4404。