[發明專利]一種人腺病毒四重實時熒光PCR檢測引物、探針、試劑盒及檢測方法

在審

• 申請號: 202110397591.0
• 申請日: 2021-04-14
• 公開（公告）號: CN113046485A
• 公開（公告）日: 2021-06-29
• 發明（設計）人: 龔甜;李健雄;肖芳
• 申請（專利權）人: 江西省疾病預防控制中心
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 南昌華成聯合知識產權代理事務所(普通合伙) 36126
• 代理人: 黃晶

1.一種人腺病毒四重實時熒光PCR檢測引物和檢測探針，其特征在于，可同時實現人腺病毒B3型、B7型、B55型和E4型四個型別的檢測，所述檢測引物和檢測探針的核苷酸序列如下：

F1：5'-cttacaattcactcgctc-3'；

R1：5'-ggcttttcttctccttca-3'；

F2：5'-ggcacagcttacaattca-3'；

R2：5'-tctcccgttgtaactatc-3'；

F3：5'-tacggcttacaactctct-3'；

R3：5'-ctcctcaccattttttacac-3'；

F4：5'-gggaaaactcattgcaaac-3'；

R4：5'-ggaaatggtgttgttgga-3'；

P1：5'-cagtaactaccaccacaaacaca-3'；

P2：5'-tgattgtgtgcgtctgaggt-3'；

P3：5'-cgcgcctaacacatctca-3'；

P4：5'-aaaactgagaggggcaatgg-3'；

其中，F1~F4、R1~R4為檢測引物，F1和R1、F2和R2、F3和R3、F4和R4構成四對引物對，P1~P4為檢測探針。

2.根據權利要求1所述的一種人腺病毒四重實時熒光PCR檢測引物和檢測探針，其特征在于，所述檢測探針中序列5' 端標記的熒光基團為FAM、HEX、VIC、CY5、JOE或ROX。

3.根據權利要求2所述的一種人腺病毒四重實時熒光PCR檢測引物和檢測探針，其特征在于，所述檢測探針中序列3' 端標記的淬滅基團為TAMRA、MGB或BHQ，其中BHQ包括BHQ1、BHQ2和BHQ3三種淬滅基團。

4.根據權利要求3所述的一種人腺病毒四重實時熒光PCR檢測引物和檢測探針，其特征在于，所述檢測探針P1、P2、P3和P4的5' 端標記的熒光基團各不相同。

5.一種人腺病毒四重實時熒光PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述檢測試劑盒中包括權利要求1~4任一權利要求所述的檢測引物和檢測探針。

6.一種人腺病毒四重實時熒光PCR檢測方法，其特征在于，包括如下步驟：

S1：從樣品中提取病毒DNA；

S2：以提取的病毒DNA為模板，用權利要求1~4任一權利要求所述的檢測引物和檢測探針進行熒光PCR擴增；熒光PCR擴增反應條件為：95℃條件下擴增反應30sec、95℃條件下擴增反應5sec與60℃條件下擴增反應30sec；其中，95℃條件下擴增反應5sec與60℃條件下擴增反應30sec進行40個循環；

S3：根據擴增曲線來判斷樣品中的病毒類型。

7.根據權利要求6所述的一種人腺病毒四重實時熒光PCR檢測方法，其特征在于，所述樣品來自于病人的結膜拭子，包括但不限于鼻咽拭子和眼結膜拭子。

8.根據權利要求6所述的一種人腺病毒四重實時熒光PCR檢測方法，其特征在于，步驟S2中的熒光PCR擴增反應體系為：

Premix Ex Taq反應：12.5μL；

25μM 檢測引物F1：0.5μL；

25μM 檢測引物R1：0.5μL；

25μM 檢測引物F2： 0.5μL；

25μM 檢測引物R2：0.5μL；

25μM 檢測引物F3：0.5μL；

25μM 檢測引物R3：0.5μL；

25μM 檢測引物F4：0.5μL；

25μM 檢測引物R4：0.5μL；

25μM 檢測探針P1：0.5μL；

25μM 檢測探針P2：0.5μL；

25μM 檢測探針P3：0.5μL；

25μM 檢測探針P4：0.5μL；

ddH2O：1.5μL；

DNA模板：5μL；

總體積：25μL。