[發(fā)明專利]腈水合酶賴氨酸突變體HBA-K2H2、編碼基因及應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110396840.4
• 申請日: 2021-04-13
• 公開（公告）號(hào): CN113151233B
• 公開（公告）日: 2022-08-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 柳志強(qiáng);沈驥冬;蔡雪;金利群;徐建妙;鄭裕國
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江工業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N9/88
• 分類號(hào): C12N9/88;C12N15/60;C12N15/70;C12N1/21;C12P17/12;C12R1/19
• 代理公司: 浙江千克知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 33246
• 代理人: 冷紅梅

本發(fā)明公開了一種本發(fā)明涉及一種腈水合酶突變體，具體涉及一種腈水合酶賴氨酸突變體HBA?K2H2及其編碼基因，含有該突變體編碼基因的質(zhì)粒及重組菌，以及該腈水合酶賴氨酸突變體HBA?K2H2在催化有機(jī)腈化合物制備酰胺化合物中的應(yīng)用。所述突變體HBA?K2H2的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其最適pH為9.0，最適溫度為35℃。與野生酶HBA相比，突變腈水合酶HBA?K2H2的堿性活力得到了改良，可應(yīng)用于生物催化生產(chǎn)丙烯酰胺、煙酰胺及其它高附加值的酰胺類化合物，化工纖維表面改性和堿性污水處理等生物技術(shù)領(lǐng)域。

(一)技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種腈水合酶突變體，具體涉及一種腈水合酶賴氨酸突變體HBA-K2H2及其編碼基因，含有該突變體編碼基因的質(zhì)粒及重組菌，以及該腈水合酶賴氨酸突變體HBA-K2H2在催化有機(jī)腈化合物制備酰胺化合物中的應(yīng)用。

(二)背景技術(shù)

腈水合酶能夠通過水和作用將各種有機(jī)腈化合物的氰基轉(zhuǎn)換成酰胺基，與化學(xué)水解法相比生物轉(zhuǎn)化法具有效率高、條件溫和、環(huán)境污染小、并能在無額外引入保護(hù)/修飾基團(tuán)的情況下實(shí)現(xiàn)化學(xué)、區(qū)域和對(duì)映體選擇性等優(yōu)點(diǎn)。為了在工業(yè)上利用腈水合酶催化生產(chǎn)丙烯酰胺、煙酰胺、吡嗪酰胺等酰胺類化合物，降低該酶的制造成本在酰胺化合物的制造成本中所占的比例尤為重要。具體而言，必須提高單位重量酶制備物中腈水合酶的含量。隨著生物技術(shù)的迅速發(fā)展，用基因工程技術(shù)手段來構(gòu)建具有腈水合酶活性的基因重組菌株可以用來克服上述的缺點(diǎn)。此外，利用基因重組菌來表達(dá)腈水合酶可以定向表達(dá)腈水合酶，以避免催化反應(yīng)過程中副反應(yīng)的發(fā)生，確保酰胺類目標(biāo)產(chǎn)物在產(chǎn)生的過程中不被部分水解，從而提高酰胺產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量。

腈水合酶的基本結(jié)構(gòu)單位是由α亞基和β亞基結(jié)合而成的二聚體，結(jié)構(gòu)單位進(jìn)一步結(jié)合形成4～12聚體(根據(jù)來源的物種不同而不同)而發(fā)揮活性。腈水合酶在表達(dá)翻譯的過程中需要攝入金屬離子(鐵離子或鈷離子)，并伴隨金屬離子配位發(fā)生的現(xiàn)象，其活性中心區(qū)域的2個(gè)半胱氨酸殘基在翻譯后發(fā)生氧化修飾。腈水合酶的翻譯后成熟的過程需要特定的分子伴侶來協(xié)助腈水合酶攝入金屬離子。但是，還沒有任何發(fā)明公開關(guān)于在沒有分子伴侶協(xié)助的情況下，鈷型腈水合酶能主動(dòng)完成翻譯后修飾的實(shí)例，同時(shí)也沒有任何發(fā)明公開能人工調(diào)節(jié)腈水合酶翻譯后自修飾效率的具體方法。

(三)發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種堿性活力改良且無需共表達(dá)分子伴侶的鈷型腈水合酶突變體HBA-K2H2腈水合酶賴氨酸突變體HBA-K2H2，含有該突變體編碼基因的質(zhì)粒及重組菌，以及該腈水合酶賴氨酸突變體HBA-K2H2在催化有機(jī)腈化合物制備酰胺化合物中的應(yīng)用。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

一種腈水合酶賴氨酸突變體HBA-K2H2，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

SEQ ID NO.1序列如下：

本發(fā)明還涉及編碼所述的腈水合酶賴氨酸突變體HBA-K2H2的基因。具體的，所述編碼基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。所述突變體HBA-K2H2的最適pH為9.0，最適溫度為35℃，比活力為252.1±4.2 U/mg。

SEQ ID NO.2序列如下：

本發(fā)明還涉及含有編碼所述腈水合酶賴氨酸突變體HBA-K2H2的基因的質(zhì)粒，以及利用該質(zhì)粒獲得的含有編碼所述腈水合酶賴氨酸突變體HBA-K2H2的基因的重組菌。

本發(fā)明還涉及所述腈水合酶賴氨酸突變體HBA-K2H2在催化有機(jī)腈化合物制備酰胺化合物中的應(yīng)用。

具體的，所述催化反應(yīng)在35～45℃、pH8.0～9.0條件下進(jìn)行。