[發明專利]一種高產核酸片段的制備方法

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• 申請號: 202110396644.7
• 申請日: 2021-04-13
• 公開（公告）號: CN112921030A
• 公開（公告）日: 2021-06-08
• 發明（設計）人: 張永正;馬詩敏;張征立;李洋;康濤
• 申請（專利權）人: 江蘇耀海生物制藥有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12N15/63
• 代理公司: 深圳龍圖騰專利代理有限公司 44541
• 代理人: 姜書新

本發明適用于生物技術領域，提供了一種高產核酸片段的制備方法，該制備方法包括以下步驟：在目標基因序列的5′和3′端分別引入同一個限制性內切酶的識別位點，以便經單一酶切獲取目的基因片段，并保證片段的均一性；利用酶切、連接方式將目的基因片段與載體骨架連接成一種含有至少2Copy的目的基因片段的重組質粒。擴增并收集重組質粒，利用單一限制性內切酶酶切重組質粒，得到酶切液；將酶切液利用AKTA經陰離子交換樹脂分離純化，獲得目的基因片段。該方法實現了單一批次目的基因片段的高產出，降低了發酵及純化的規模和批次量，縮短了生產周期，提高了設備利用率，增加了經濟效益。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，尤其涉及一種高產核酸片段的制備方法。

背景技術

核酸片段的制備主要通過合成、PCR擴增方法及通過質粒擴增后酶切獲取，其中PCR方法因體外聚合酶識別、添加、切割過程中的低概率的突變的存在難以保證批間的均一性，而從質粒中酶切獲取核酸片段由于細胞內復雜的復制機制可以有效保證基因序列的穩定，限制性內切酶又是專一性切割，保證了目標核酸片段的批間一致性。因此，通常更傾向于采用質粒酶切方式獲取大量質量均一的目標核酸片段。

在核酸片段的制備過程中，先通過PCR擴增或者全序列合成獲得目標核酸片段，將其插入到質粒載體中獲得重組質粒，通過重組質粒的擴增與酶切，最終獲取大量的目標核酸片段。通常重組質粒中只含有一個Copy的目標核酸片段，在目標核酸片段需求量比較低時，低收率的目標核酸片段亦能滿足需求，但當需求量比較大時，目標核酸片段產量較低問題就變得異常突出，物料需求增多，生產周期延長，直接導致經濟效益的低下。因此如何提高單位質粒中目標核酸片段的含量成為提高經濟效益亟需解決的一大問題。

發明內容

本發明實施例的目的在于提供一種高產核酸片段的制備方法，旨在解決背景技術中提出的問題。

本發明實施例是這樣實現的，一種高產核酸片段的制備方法，其包括以下步驟：

在目標基因序列的5′和3′端分別引入同一個限制性內切酶的識別位點，以便經單一酶切獲取目的基因片段，并保證片段的均一性；

利用酶切、連接方式將目的基因片段與載體骨架連接成一種含有至少2Copy的目的基因片段的重組質粒。

擴增并收集重組質粒，利用單一限制性內切酶酶切重組質粒，得到酶切液；

將酶切液利用AKTA經陰離子交換樹脂分離純化，收集目的基因片段。

作為本發明實施例的另一種優選方案，所述步驟中，引入的限制性內切酶的識別位點為同一個酶。

作為本發明實施例的另一種優選方案，所述步驟中，重組質粒含有2～10個Copy的目的基因片段。

作為本發明實施例的另一種優選方案，所述步驟中，重組質粒含有2～3個Copy的目的基因片段。

作為本發明實施例的另一種優選方案，所述步驟中，目的基因片段的獲取是通過直接酶切或者PCR與酶切相結合方法獲取含有目的基因片段的酶切產物，經電泳分離、回收和純化處理，得到目的基因片段。

作為本發明實施例的另一種優選方案，所述步驟中，載體骨架為去磷酸化載體骨架片段，其是通過直接酶切或者PCR與酶切相結合方法獲取含有ORI區和抗生素抗性基因區的載體骨架片段的酶切產物，經電泳分離、回收和純化處理，得到載體骨架片段；然后將載體骨架片段進行去磷酸化處理后，再經純化回收，得到去磷酸化載體骨架片段。

作為本發明實施例的另一種優選方案，所述抗生素抗性基因為卡那霉素抗性基因，以避免抗生素殘留及抗性基因向環境的擴散。

本發明實施例提供的一種高產核酸片段的制備方法，其首先根據“質量源于設計”的理念，從質粒層面著手，增加質粒中目標基因片段的含量，進而提高單位發酵液中質粒的含量，提高了單一批次的目標基因片段的產量。