[發明專利]一種豬偽狂犬活疫苗中外源病毒快速檢測引物及其在試劑盒中的應用

在審

• 申請號: 202110396251.6
• 申請日: 2021-04-13
• 公開（公告）號: CN112877479A
• 公開（公告）日: 2021-06-01
• 發明（設計）人: 于新友;王金良;沈志強;孟衛芹;李天芝;魏鳳;董林
• 申請（專利權）人: 山東省濱州畜牧獸醫研究院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 濟南舜源專利事務所有限公司 37205
• 代理人: 牟京霞

本發明提供了一種豬偽狂犬活疫苗中外源病毒快速檢測引物及其在試劑盒中的應用，該引物包括針對非洲豬瘟病毒的特異性引物Ⅰ、針對牛病毒性腹瀉病毒的特異性引物Ⅱ和針對豬圓環病毒2型的特異性引物Ⅲ；將引物應用于試劑盒中，在一個反應體系中同時完成非洲豬瘟病毒(ASFV)、牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)和豬圓環病毒2型(PCV2)三種病原快速篩查檢測；通過檢測引物的設置，可提高檢測ASFV、BVDV、PCV2三種病原的特異性、穩定性和靈敏度；該試劑盒在應用時，具有操作簡單、檢測時間短、且不受檢測人員水平和實驗室水平限制的優點。

技術領域

本發明屬于分子生物學檢驗的技術領域，尤其涉及一種豬偽狂犬活疫苗中外源病毒快速檢測引物及其在試劑盒中的應用。

背景技術

豬偽狂犬病是由偽狂犬病毒(PRV)引起的一種急性病毒性傳染病，臨床表現主要為母豬流產、產木乃伊胎、產弱仔、初生仔豬腹瀉及神經癥狀，感染率和死亡率可達100％，是豬群常見、多發的重要疾病之一，嚴重危害豬養殖業的發展。當前，豬偽狂犬病無有效治療方法，主要通過活疫苗接種進行預防。

豬偽狂犬病毒活疫苗生產中需要用到種毒、血清、胰蛋白酶及細胞基質等多種原輔材料，這些原輔材料均由動物源性物質制備，具有污染各種病毒的風險，有一定的生物安全隱患。

目前，在疫苗生產中，用到的血清多為牛血清，其中牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)存在較為普遍，牛病毒性腹瀉病毒可引起牛黏膜發炎、糜爛、壞死以及腹瀉等，在牛群中流行已相當嚴重，豬群也有感染和發病報道，癥狀類似豬偽狂犬，且與豬偽狂犬很難通過血清學方法鑒別，對養豬業潛在的危害不可忽視；胰蛋白酶多為豬源材料制備，而在豬群中廣泛存在的圓環病毒2型(PCV2)對該材料有很高的污染幾率，豬群圓環病毒2型(PCV2)在豬群中廣泛存在，可與其他豬病混感在成一定經濟損失；在疫苗等物資進豬場的過程中，攜帶的外源病毒也是不可忽視的方面，以非洲豬瘟病毒(ASFV)為例，一旦攜帶進入豬場，則會使豬場遭受毀滅性的打擊；可見，活疫苗中的外源病毒和活疫苗物資外部攜帶的外源病毒在活疫苗出廠前均需進行檢驗，以避免活疫苗接種給動物造成巨大的安全隱患，在攜帶外源病毒的活疫苗接種動物體并在動物體內增值、隨著動物排泄而排放到環境中后，會引起嚴重的生物安全問題，因此，在豬偽狂犬病毒活疫苗出廠前或使用前必須對ASFV、BVDV、PCV2等外源病毒檢驗。

疫苗外源病毒檢驗一直是困擾各獸用生物制品生產企業檢驗人員的難點內容，目前，對疫苗外源病毒檢測方法為熒光抗體檢查、致細胞病變檢查和紅細胞吸附試驗等細胞培養法，這些方法操作繁瑣、時間長、對人員水平和實驗室條件要求較高，很難滿足疫苗生產企業和豬場快速疫苗檢驗的需求，因此，提供一種易于操作、檢測效率高、環境污染小的檢測方法對豬場快速疫苗檢測具有重要意義。

熒光PCR已作為一種快速、靈敏、便宜的診斷方法被廣泛使用，與傳統PCR檢測比，敏感性高，不需要開蓋電泳檢測PCR產物，減少實驗室氣溶膠污染風險；該檢測方法不僅能能確定是否有外源病毒污染，還可以確定被污染的外源病毒的種類，因此，熒光PCR檢驗可作為生物制品外病毒的一種檢驗手段以提高豬偽狂犬病毒活疫苗外源病毒檢測效率。然而，當前國內外還未有同時檢測ASFV、BVDV、PCV2的多重熒光PCR檢測試劑盒，使對活疫苗檢測需要分步進行，在浪費檢測時間的同時，增加了勞動量、降低了檢測效率，因此，設計一種同時對ASFV、BVDV、PCV2進行檢測的試劑盒以滿足實際疫苗快速品控的需求具有重要意義。

發明內容

針對現有技術的上述不足，本發明提供了一種豬偽狂犬活疫苗中外源病毒快速檢測引物及其在試劑盒中的應用，以滿足豬偽狂犬活疫苗外源病毒檢測時，在一個反應體系中同時完成非洲豬瘟病毒(ASFV)、牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)和豬圓環病毒2型(PCV2)三種病原快速篩查檢測；通過檢測引物的設置，可提高檢測ASFV、BVDV、PCV2三種病原的特異性、穩定性和靈敏度；該試劑盒在應用時，具有操作簡單、檢測時間短、且不受檢測人員水平和實驗室水平限制的優點。

本發明的技術方案如下：