[發(fā)明專利]一種具有高活力和高轉化率的蔗糖異構酶突變體及應用

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• 申請日: 2021-04-13
• 公開（公告）號: CN113174385A
• 公開（公告）日: 2021-07-27
• 發(fā)明（設計）人: 費穎;李舒宇;程慧君;樊啟磊
• 申請（專利權）人: 蘇州朗邦營養(yǎng)科技有限公司
• 主分類號: C12N9/90
• 分類號: C12N9/90;C12N15/61;C12N15/70;C12N15/77;C12N1/21;C12P19/12;C12P19/24;C12R1/19;C12R1/15
• 代理公司: 無錫承果知識產(chǎn)權代理有限公司 32373
• 代理人: 張婷婷

本發(fā)明公開了一種具有高活力和高轉化率蔗糖異構酶突變體及應用，屬于基因工程技術領域。該突變體包括突變體Y246L、H287R、H481P，屬于基因工程技術領域。本發(fā)明通過設計定點突變引物，對基因進行定點突變，獲得編碼突變體的基因，并在大腸桿菌表達系統(tǒng)中進行表達，得到的蔗糖異構酶突變體活力和轉化率顯著提高。本發(fā)明制備的蔗糖異構酶突變體是一種更高效的生物催化劑，在異麥芽酮糖的工業(yè)生產(chǎn)中應用可以提高生產(chǎn)效率，減少生產(chǎn)成本。

技術領域

本發(fā)明涉及一種具有高活力和高轉化率的蔗糖異構酶突變體及應用，屬于基因工程技術領域。

背景技術

異麥芽酮糖(isomaltulose)又稱帕拉金糖，分子式為C₁₂H₂₂O₁₁，是一種功能性二糖，屬蔗糖同分異構體，為還原性糖，可被加氫還原。異麥芽酮糖晶體呈正交晶體，含水時異麥芽酮糖晶體的相對分子質(zhì)量變?yōu)?60.32，熔點為120-128℃，25℃時水溶性為250g/L；與蔗糖相比甜度自然且甜度為其52％，因而可作為新型甜味劑替代蔗糖。

美國FDA批準異麥芽酮糖作為安全型食品添加劑，無攝入量限制。其所具有的理化性質(zhì)和生理功能也使得異麥芽酮糖能夠替代蔗糖廣泛的應用于功能飲料，減肥保健品，糖尿病人食品中等。我國糖尿病患者，肥胖綜合癥患者數(shù)以千萬計，因而成為異麥芽酮糖工業(yè)化生產(chǎn)的市場保證。目前，全球已有40多個國家和地區(qū)已開始使用異麥芽酮糖來替代蔗糖作為食品添加劑，其中歐美與日本使用最多，2009年消耗量就已經(jīng)達到100000t。而就我國而言，異麥芽酮糖需求量大，而國內(nèi)異麥芽酮糖的工業(yè)化生產(chǎn)起步晚產(chǎn)能低，因而所需產(chǎn)品主要依賴德國和日本的進口，其中該糖的市場售價為1.5萬元/t。

異麥芽酮糖在自然界極少，只少量的存在于蜂蜜和甘蔗汁中，因而直接的提取方法不可用。目前，經(jīng)文獻報道的異麥芽酮糖合成方法主要有：化學合成法、植物體內(nèi)轉化法、微生物細胞轉化法、蔗糖異構酶轉化法。化學合成法成本高且污染大，植物體內(nèi)轉化法會導致植物生產(chǎn)停滯，而微生物細胞轉化法由于發(fā)酵液成分復雜，導致后期分離純化困難。故目前生產(chǎn)異麥芽酮糖的最佳方式為蔗糖異構酶轉化法。

蔗糖異構酶，又稱α-葡糖基轉移酶，能夠將蔗糖轉化成異麥芽酮糖和海藻酮糖，并生成少量單糖的一種酶。蔗糖異構酶的催化機理：親核攻擊作用蔗糖使α1-β1糖苷鍵斷裂及果糖基的取向；異構化或水解的發(fā)生。蔗糖異構化過程即蔗糖異構酶催化蔗糖轉化的兩種去向如圖4所示。

用蔗糖異構酶來實現(xiàn)異麥芽酮糖的高產(chǎn)率，高純度，低成本的生產(chǎn)始終是蔗糖異構酶研究的方向。在用蔗糖異構酶生產(chǎn)異麥芽酮糖的過程中，酶的利用率低和不可避免生成的副產(chǎn)物是兩個重要的不利因素，且因為這兩個因素使得異麥芽酮糖的生產(chǎn)成本維持在較高水平，而高成本也限制了異麥芽酮糖替代蔗糖的步伐。與單糖副產(chǎn)物的產(chǎn)生相比，在使用蔗糖異構酶的過程中，產(chǎn)生蔗糖的另一種同分異構體——海藻酮糖，由于其和異麥芽酮糖結構的相似性，使得下游分離純化的難度提高，一般工業(yè)上分離海藻酮糖與異麥芽酮糖使用重結晶的方法。更高的異麥芽酮糖轉化率意味著在生產(chǎn)過程中，可以使異麥芽酮糖的產(chǎn)率更高，或生產(chǎn)純度更高的異麥芽酮糖產(chǎn)品。與此同時，提高蔗糖異構酶的酶活，可以提高生產(chǎn)效率，減少生產(chǎn)成本。

為了獲得更高效的生物催化劑，篩選新的并且可能具有高效率生成異麥芽酮糖的蔗糖異構酶是當前的關鍵任務。

發(fā)明內(nèi)容

發(fā)明目的：為了克服現(xiàn)有技術中存在的不足，本發(fā)明提供一種具有高活力和高轉化率的蔗糖異構酶突變體、工程菌及應用，通過定點突變的辦法，對篩選到的蔗糖異構酶進行分子改造，從而進一步提高其催化活性并得到更適合于工業(yè)應用的蔗糖異構酶。

技術方案：本發(fā)明采用的技術方案如下。

本發(fā)明的第一個目的是，提供一種具有高活力和高轉化率的蔗糖異構酶突變體，該蔗糖異構酶突變體的氨基酸序列如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8其中任意一種所示。