[發明專利]一種基因缺失的減毒非洲豬瘟病毒毒株及其構建方法和應用

有效

• 申請號: 202110394476.8
• 申請日: 2021-04-13
• 公開（公告）號: CN113122511B
• 公開（公告）日: 2021-11-19
• 發明（設計）人: 宋慶慶;葉正琴;陳鴻軍;王衡;狄棟棟;武瑾賢;龔浪;屠頡;謝振華;陳堅;劉建奇;徐麗媛;趙麗霞;劉英楠;張翀宇
• 申請（專利權）人: 金宇保靈生物藥品有限公司;華南農業大學;中國農業科學院上海獸醫研究所
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;C12N7/04;C12N15/85;C12N15/34;A61K39/12;A61P31/20;C12R1/93
• 代理公司: 北京尚誠知識產權代理有限公司 11322
• 代理人: 葉占洋;魯兵

1.一種基因缺失的減毒非洲豬瘟病毒毒株，其在II型非洲豬瘟病毒的基因組中缺失以下基因或片段：

CD2V基因、MGF360（12L,13L,14L）和I177L基因片段，所述MGF360（12L,13L,14L）表示MGF360-12L基因、MGF360-13L基因和MGF360-14L基因這3個連續的基因序列，其中所述I177L基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示。

2.根據權利要求1所述的減毒非洲豬瘟病毒毒株，其中所述II型非洲豬瘟病毒包括但不限于ASFV-SY18、Georgia 2008/1、Pig/HLJ/2018、Georgia 2007/1、ASFV GZ2018。

3.權利要求1或2所述的減毒非洲豬瘟病毒毒株的構建方法，其包括以下步驟：通過基因工程手段將親本II型非洲豬瘟病毒的CD2V基因、MGF360（12L,13L,14L）基因和I177L基因片段缺失。

4.根據權利要求3所述的構建方法，其中所述基因工程手段為同源重組技術，具體包括以下步驟：

S1）將MGF360（12L,13L,14L）基因的左右同源臂和第一篩選表達盒克隆至pBluescriptII KS載體，獲得第一同源重組轉移載體；

S2）將CD2V基因的左右同源臂和第二篩選表達盒克隆至pBluescript II KS載體，獲得第二同源重組轉移載體；

S3）將I177L基因片段的左右同源臂和第三篩選表達盒克隆至pBluescript II KS載體，獲得第三同源重組轉移載體；

S4）將步驟S1）的第一同源重組轉移載體用轉染試劑轉染至使用所述親本II型非洲豬瘟病毒感染的原代PAM細胞中，通過所述第一篩選表達盒篩選獲得缺失MGF360（12L,13L,14L）基因的第一重組病毒；

S5）將步驟S2）的第二同源重組轉移載體用轉染試劑轉染至使用步驟S4）獲得的第一重組病毒感染的原代PAM細胞中，通過所述第一篩選表達盒和第二篩選表達盒篩選獲得同時缺失MGF360（12L,13L,14L）基因和CD2V基因的第二重組病毒；

S6）將步驟S3）的第三同源重組轉移載體用轉染試劑轉染至使用步驟S5）獲得的第二重組病毒感染的原代PAM細胞中，通過所述第一篩選表達盒、第二篩選表達盒和第三篩選表達盒篩選獲得同時缺失MGF360（12L,13L,14L）基因、CD2V基因和I177L基因片段的第三重組病毒，作為減毒非洲豬瘟病毒毒株。

5.根據權利要求4所述的構建方法，其中所述第一篩選表達盒、第二篩選表達盒和第三篩選表達盒為不同的篩選表達盒，均選自mCherry、EGFP和EBFP表達盒。

6.一種非洲豬瘟病毒減毒活疫苗，其由權利要求1或2所述的基因缺失的減毒非洲豬瘟病毒毒株制備獲得。

7.根據權利要求6所述的非洲豬瘟病毒減毒活疫苗，其中的減毒非洲豬瘟病毒的病毒含量≥10^7.0TCID₅₀/ml。

8.權利要求6或7所述的非洲豬瘟病毒減毒活疫苗的制備方法，其包括以下步驟：

T1）將權利要求1或2所述的基因缺失的減毒非洲豬瘟病毒毒株接種原代PAM細胞，擴大培養，收獲病毒液；

T2）以病毒含量≥10^7.0TCID₅₀/ml的病毒液直接或配合佐劑制成疫苗。

9.根據權利要求8所述的制備方法，其中所述佐劑包括但不限于納米佐劑、白介素和干擾素。