[發明專利]一種ispc-PcopA-yoeBVp

有效

• 申請號: 202110392911.3
• 申請日: 2021-04-13
• 公開（公告）號: CN113061621B
• 公開（公告）日: 2023-07-21
• 發明（設計）人: 鄭成坤;衛慢;邱軍
• 申請（專利權）人: 揚州大學
• 主分類號: C12N15/74
• 分類號: C12N15/74;C12N15/65;C12N15/64;C12R1/46
• 代理公司: 揚州蘇中專利事務所(普通合伙) 32222
• 代理人: 沈志海

一種spc?PcopA?yoeBsubgt;Vp/subgt;基因盒及其制備方法，屬于基因工程技術領域，包含正篩選標記spc和負篩選標記PcopA?yoeBsubgt;Vp/subgt;。負篩選標記在硫酸銅誘導下表達YoeBsubgt;Vp/subgt;毒素，能抑制中間菌株的生長。利用該基因盒，可以高效地實現豬鏈球菌無痕基因敲除。基因敲除突變株不含任何抗性標記，避免了抗性標記導致的極性效應。此外，因為不含抗性標記，基因敲除突變株可用于后續的疫苗研究。

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，涉及一種基于同源重組將豬鏈球菌目的基因無痕敲除的負篩選標記，具體的說是涉及一種 spc-P copA- yoeB_Vp基因盒及其制備方法和應用。

背景技術

豬鏈球菌( Streptococcus?suis，簡稱 S.suis)是一種兼性厭氧的革蘭氏陽性病原菌，可以感染豬，導致腦膜炎、敗血癥、肺炎、心內膜炎和關節炎等，給全球豬養殖業帶來巨大的經濟損失。此外，豬鏈球菌可以通過皮膚傷口和胃腸道途徑感染人，導致腦膜炎和鏈球菌中毒性休克綜合征等，給公眾健康帶來嚴重危害。1998年和2005年，我國江蘇省和四川省分別暴發大規模豬鏈球菌疫情，不僅導致大量豬死亡，還分別導致25人感染14人死亡和215人感染39人死亡。截止到2013年底，全球范圍內報道的人感染豬鏈球菌病例超過1600例，其中一些是死亡病例。近年來，國內外仍然經常報道人感染豬鏈球菌的病例，說明豬鏈球菌的威脅持續存在。

基因敲除是將基因組中特定的基因進行缺失或失活的分子生物學技術。該技術對研究豬鏈球菌的致病機制極為重要。在豬鏈球菌中，最常用的基因敲除方法是基于pSET4s溫敏型自殺質粒的同源重組法。由于該方法沒有用到負篩選標記，突變株要從大量候選菌株中篩選出來，需要花費大量時間。此外，電轉化法不能用于Chz型豬鏈球菌菌株。基于自然轉化和抗性篩選的方法也被用于豬鏈球菌的基因敲除，但該方法產生的突變株攜帶抗生素抗性基因(即有痕)，不能用于疫苗研究。最近，蔗糖敏感基因( sacB)和壯觀霉素抗性基因( spc)組成的基因盒( sacB-spc)被用于豬鏈球菌的無痕基因敲除。但該基因盒較大，加上目的基因的左右同源臂，通常在4000?bp以上，不利于PCR擴增及后續鑒定；該方法的另一個缺點是，常有一些細菌細胞對 sacB基因的表達產物表現出抗性，限制了 sacB作為負篩選標記的應用。因此，開發新的負篩選標記用于豬鏈球菌無痕基因敲除具有重要意義。

發明內容