[發(fā)明專利]一種用于釋放被紅細(xì)胞仿生材料捕獲的腫瘤細(xì)胞的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110392836.0
• 申請日: 2021-04-13
• 公開（公告）號: CN113088494B
• 公開（公告）日: 2022-08-05
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉威;彭偉;張?zhí)找?/a>
• 申請（專利權(quán)）人: 武漢大學(xué)
• 主分類號: C12N5/09
• 分類號: C12N5/09
• 代理公司: 武漢科皓知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 42222
• 代理人: 常海濤

本發(fā)明公開了一種用于釋放被紅細(xì)胞仿生材料捕獲的腫瘤細(xì)胞的方法，屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)通過完全培養(yǎng)基的作用可以實現(xiàn)DSPE?PEG?X分子從紅細(xì)胞膜中脫落，本發(fā)明方法為將捕獲腫瘤細(xì)胞的紅細(xì)胞仿生材料用培養(yǎng)基進行孵育，經(jīng)過孵育腫瘤細(xì)胞從紅細(xì)胞仿生材料上得到釋放；所述的紅細(xì)胞仿生材料包括修飾了DSPE?PEG?X(X代表FA、RGD或biotin)的純紅細(xì)胞、納米材料修飾的紅細(xì)胞、紅細(xì)胞團簇、平面紅細(xì)胞仿生層等。通過本發(fā)明方法釋放的腫瘤細(xì)胞無需對其進行換液處理，可直接在完全培養(yǎng)基的條件下進行培養(yǎng)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于釋放被紅細(xì)胞仿生材料捕獲的腫瘤細(xì)胞的方法。

背景技術(shù)

腫瘤局部或區(qū)域的復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，對于腫瘤的早期診斷以及腫瘤治愈提出了嚴(yán)峻的考驗。近些年分子生物學(xué)及臨床研究顯示，循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells,CTCs)導(dǎo)致了腫瘤的侵襲和微轉(zhuǎn)移過程的發(fā)生。CTCs是由原本的腫瘤細(xì)胞從原發(fā)腫瘤脫落，進入人體的血液系統(tǒng)所形成的，CTCs經(jīng)過外周血的循環(huán)、擴散，最終轉(zhuǎn)移到人體的其他組織和器官，進而形成與原發(fā)部位腫瘤相同類型的繼發(fā)腫瘤，即造成了腫瘤和癌癥的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。通過捕獲外周血中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞，分析外周血中循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)量隨時間的變化，可以更早預(yù)測腫瘤預(yù)后，為癌癥用藥的治療反應(yīng)檢測和放化療療效分析提供一個簡便易行的方法和手段。

由于外周血中的CTCs含量很低，每毫升血液中僅有幾個至幾十個CTCs，而背景血細(xì)胞含量則達(dá)到了10⁹量級，對CTCs分離富集檢測產(chǎn)生了極大的干擾，因此好的CTCs分離富集要求其具有高靈敏度和高選擇性，同時還應(yīng)能夠保持CTCs的活性。目前已經(jīng)開發(fā)了眾多CTCs分離富集方法，包括基于物理性質(zhì)不同(尺寸、密度、介電泳等)的分離方法和表面修飾抗體的免疫親和法。由于CTCs與白細(xì)胞的物理性質(zhì)有一定的重疊，很難從分離的CTCs中有效地去除白細(xì)胞，這就造成了只基于一種物理性質(zhì)的分離方法難以同時獲得高效率和高純度。基于表面修飾抗體的免疫親和法可以特異性靶向CTCs上的抗原，雖然抗原-抗體的結(jié)合具有高特異性，但由于常規(guī)材料對于無關(guān)細(xì)胞存在一定的非特異性吸附，會對實際分離的CTCs純度造成不良影響。

為了盡量減少修飾抗體的材料對無關(guān)細(xì)胞的非特異性吸附，現(xiàn)有技術(shù)中有一類方法是設(shè)計基于紅細(xì)胞的仿生材料，包括了純紅細(xì)胞、納米材料修飾的紅細(xì)胞、紅細(xì)胞團簇以及平面紅細(xì)胞仿生層等。這一類材料的共同點是紅細(xì)胞作為循環(huán)腫瘤細(xì)胞的捕獲界面，其界面處為紅細(xì)胞的生物膜結(jié)構(gòu)，利用親疏水作用力在細(xì)胞膜的磷脂雙分子層中插入DSPE-PEG-X(X代表FA或者biotin)類型的分子，再利用biotin-SA的特異性結(jié)合方式修飾上可特異性靶向循環(huán)腫瘤細(xì)胞表面抗原的抗體分子(FA可直接靶向循環(huán)腫瘤細(xì)胞)。而生物膜結(jié)構(gòu)對于其他無關(guān)細(xì)胞則具有優(yōu)良的防非特異性吸附的能力，這樣即可實現(xiàn)對循環(huán)腫瘤細(xì)胞的高純度富集。

為了后續(xù)的培養(yǎng)分析，往往需要將富集到的高純度循環(huán)腫瘤細(xì)胞進行釋放。對于基于紅細(xì)胞的這類仿生材料來說，已知的對其表面捕獲的循環(huán)腫瘤細(xì)胞的釋放方法是紅細(xì)胞裂解液釋放法。市面上的紅細(xì)胞裂解液包含兩類，一類是酶類裂解液，其中含有可以攻擊特定紅細(xì)胞表面抗原的酶，可造成紅細(xì)胞變形，生物通道擴大膨脹裂解，或者引起紅細(xì)胞的變性；另一類是氯化銨型裂解液，銨根離子不能透過細(xì)胞膜，而其他離子可以通過，這樣就造成了細(xì)胞內(nèi)外的離子濃度差異，即滲透壓差，最終導(dǎo)致外部水分?jǐn)U散至細(xì)胞內(nèi)使紅細(xì)胞漲破。這兩類紅細(xì)胞裂解液都很難實現(xiàn)細(xì)胞膜雙磷脂分子層的徹底瓦解，因而其基于親疏水作用力而修飾的DSPE-PEG-X分子也難以被細(xì)胞膜釋放，那么被紅細(xì)胞裂解液作用后的變性紅細(xì)胞與循環(huán)腫瘤細(xì)胞之間的結(jié)合力依然存在，也就很難實現(xiàn)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的高效釋放。另外紅細(xì)胞裂解液不能達(dá)到100％準(zhǔn)確的裂解紅細(xì)胞，總會或多或少導(dǎo)致其他種類細(xì)胞的裂解。鑒于此，亟需探索一種高效且溫和的用于紅細(xì)胞系列捕獲材料的循環(huán)腫瘤細(xì)胞釋放方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺點與不足，提供一種用于釋放被紅細(xì)胞仿生材料捕獲的腫瘤細(xì)胞的方法。